生物技术概论-基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,学习要求,掌握基因工程的概念,DNA重组原理与技术;,熟悉外源基因转入受体细胞的各种途径;,了解基因工程研究的基本技术路线，基因工程的应用。,第一节 基因工程概述,一、复习DNA、基因的概念和结构,1.DNA的组成、结构和功能,DNA,由,腺嘌呤脱氧核苷酸（A）、鸟嘌呤脱氧核苷酸(G)、胞嘧啶脱氧核苷酸(C)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T),组成。,脱氧核苷酸由,脱氧核糖、碱基和磷酸基,组成。,四种脱氧核苷酸的脱氧核糖、磷酸基的结构和位置相同，只是各自的碱基不同。,DNA的功能,（1）DNA分子能在细胞内复制,以原有的DNA链为模板，从特定的复制起始位点,（ori）起始，复制出新的DNA链。,（2）携带遗传信息,DNA 是遗传信息的主要携带者，DNA 上的部分核苷酸序列决定着RNA的核苷酸序列。通过转录，这些核苷酸序列分别指令转录出核糖体 RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)和信使 RNA(mRNA)。,2、基因的概念和结构,基因是编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物,的遗传信息的基本单位，是具有遗传信息一段DNA序列。,结构：包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。,基因是基因工程的操作对象,原核生物基因结构,真核生物基因结构,原核生物基因启动子相关的保守核苷酸序列,Pribnow,框或,-10,区：,-4 -13bp,之间由个核苷酸组成，多数是,TATAAT,序列。,-35,区：,-35bp,前后保守的,TTGACA,序列。,动、植物基因启动子相关的保守核苷酸序列,生物,类型,TATA区,（,-25-30）,CAAT区,（,-70-80）,GC区,（,-80-100）,动物,TATAATA,GGCCAACT,GCCACACCC,植物,TCTATATA,13,CA 或,TGTATAAA,13,CA,CA,25,GNGA,24,CC或,T A,25,TNGA,24,TT,GGGCGGG,终止子发夹结构序列,终止子(termi-nator):,在基因编码区下游有一段使转录终止的核苷酸序列。,3、基因工程的概念,按照,人们的愿望,（人为的），进行,严密的设计,（类似工程设计），通过,体外DNA重组（,非生命活动过程）和,转基因,等技术，有目的地改造生物种性，使现有的物种,在较短的时间内,趋于完善（区别于自然突变和常规育种），创造出更符合人们需求的新的生物类型;利用这种技术对人类疾病进行有效的诊断和治疗。,体外,DNA,重组是基因工程的基本内容和关键技术。,自然界的,DNA,重组,-,难以预测,基因工程,-,按人的意志进行,DNA,重组,重组,DNA,技术,是指将一种,生物体（供体）,的基因与,载体,在体外进行拼接重组，然后转入另一种,生物体（受体）,内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的,DNA,体外操作程序，也称,分子克隆技术,。,因此,供体、受体、载体,是重组,DNA,技术的三大基本元件。,二、基因工程诞生的基础,（一）理论上的三大发现,1、40年代确定的遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质（肺炎双球菌实验）,2、50年代揭示的DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制。,3、50年代末60年代：,确定了遗传信息的传递方式(密码子学说，,中心法则),（二）基因工程研究的理论依据（为何可对基因进行,切、接,、,转、增,、,检,操作）,1、基因可以重组互换,2、基因可切割,3、基因可转移不同生物体之间、同一染色体上、不同人染色体之间、插入到靶DNA中）：可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状,4、多肽与基因之间存在对应关系,5、遗传密码是通用的,6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代：某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能,（三）技术上的三大发明,1、60年代末70年代：,限制性核酸内切酶的发现,2、70年代：,DNA连接酶的发现,3、70年代：基因工程载体的使用。,1973年第一次实现了重组转化成功的例子。从此基因工程诞生，这年定为基因工程诞生的元年。,三、基因工程操作的技术路线,生物材料,mRNA,RNA,DNA,cDNA,基因组文库,人工合成,目的基因,PCR扩增,酶切,技术路线,剪切,拼接,导入,表达,基因操作的基本步骤,第二节 基因工程四大要素,工具酶,载体,目的基因,受体,基因工程技术中对核酸的精雕细刻主要用酶作为工具,一、工具酶,（一）限制性内切核酸酶,1、概念,一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3,-OH和5,-P基团的DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。,什么是限制性内切酶？,由1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名系统,由三部分构成，即,菌种名、菌系编号分离顺序,。,1、用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜体）组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用,Eco,表示；,流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用,Hin,表示。,2、用一个大写字母表示菌株或型。如,Eco,k,Eco,R,3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示,分离到的第几个，正体书写,。如,Eco,R I，,Eco,R V。,命名原则？,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶,I 类限制性内切酶,II 类限制性内切酶,III类限制性内切酶,限制性内切酶系统的种类2、限制性内切核酸酶识别序列,识别双链DNA分子中,4-8对,碱基的特定序；,大部分酶的切割位点在,识别序列内部或两侧,；,识别切割序列呈典型的旋转对称型,回文结构。,同裂酶：,识别相同序列的限制酶,同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以具有相同的酶切位点。前者肯定是两种不同的限制性内切核酸酶，而后者往往是从不同生物中提取到的同一种限制性内切核酸酶。,同尾酶 (isocaudamer),与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都,能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。,G A A T T C,C T T A A G,G,C T T A A,1、黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间碱基正好互补配对。（5粘性和3粘性）,A A T T C,G,3、切割方式,EcoRI等酶切产生的5粘性末端,5G-C-T-,G,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-G-A-G3,3C-G-A-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,-C-T-C5,EcoRI 37,5G-C-T-,G,-,OH,P,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-G-A-G3,3C-G-A-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,P,HO,-,G,-C-T-C5,PstI等酶切产生的3粘性末端,5G-C-T-,C,-,T,-,G,-,C,-A,-,G,-G-A-G3,3C-G-A-,G,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-C-T-C5,PstI 37,5G-C-T-,C-T-G-C-A,-,OH,P,-,G,-G-A-G3,3C-G-A-,G,-,P,HO,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-C-T-C5,PvuII等酶切产生的平末端,5G-C-T-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-G-A-G3,3C-G-A-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-C-T-C5,P,vuII,37,5G-C-T-,C-A-G-,OH,P,-C-T-,G,-G-A-G3,3C-G-A-,G,-T-C-,P,HOG,-,A,-,C,-C-T-C5,4、,限制性内切核酸酶反应系统,反应底物,内切酶,反应缓冲液,适当的温度,5、酶切方法,单酶切方法,一个酶切反应体系（20L）：,无菌重蒸水：13L，,缓冲液（10）：2L,底物DNA：4L,酶液：1L,总体积为20L。,离心2S保温1-3h（30度或37度）终止反应（65水浴中保温10-15min，或乙醇沉淀处理，或者先用酚处理后再用乙醇沉淀处理除去酶蛋白。）,双酶切法,两种不同的酶切割同一种DNA分子的方法。,（）分别酶切,（）同时酶切,先后加入酶：,适于酶的稳定性不好的酶；需不同温度的酶。,同时加入酶：,适于酶的热稳定性强，则两种酶同时加入反应系统，待最适反应温度低的那种限制性核酸内切酶完全切割后，升温到第二种酶的最适反应温度完成第二种酶的完全切割。,完全消化（完全酶切）：,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。,部分酶切法（不完全酶切）：,只有有限数量的酶切位点被切开。,部分酶切的原因：,底物DNA的纯度低；,识别序列的甲基化；,酶用量的不足以及反应缓冲液和温度不适宜；,反应时间不足等。,（若要想部分酶切的话，则可通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。）,(二)DNA连接酶（,DNA ligase,）,能催化双链DNA片段紧靠在一起的 3OH末端与 5,P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接。,两种DNA连接酶,（1）大肠杆菌连接酶：只能连接粘性末端,（2）T4噬菌体的连接酶：连接粘性末端、齐平末端,功用：,DNA重组中促使载体与DNA连接,具互补粘性末端片段之间的连接,具平末端,DNA,片段之间的连接,DNA,片段末端修饰后进行连接,DNA,片段加连杆后或加衔接头连接,基因克隆载体的含义,能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以相对稳定维持的,DNA,分子称为基因克隆载体（,gene cloning,vector,）。,基因克隆载体应具备的基本条件,具有,1,个或多个克隆位点。,进入受体细胞后，一般是能够以不同的形式进行复制。,含有供选择克隆子的标记基因。,克隆载体必须是安全的。,二、基因克隆载,体,载体的功能,运送外源基因,高效,转入受体细胞,为外源基因提供复制能力或整合能力,为外源基因的,扩增或表达,提供必要的条件,克隆载体种类,按构建克隆载体的材料来源分,:,质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克隆载、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体,.,按克隆载体的用途分,:,一般克隆载体、表达载体、建库载体、,T,或,U,载体,.,按克隆载体的受体生物分,:,原核生物克隆载体,大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体,.,真核生物克隆载体,酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆,载体、人克隆载体,.,克隆载体种类,含义：,以质粒,DNA,分子为基础构建的克隆载体，必须含有质粒的复制起始位点。,种类：,大肠杆菌质粒载体,蓝藻穿梭质粒载体,农杆菌,Ti,质粒载体,酵母,2m,质粒载体,.,1、质粒克隆载体（重点掌握）,质粒DNA,质粒载体的一般特征,染色体DNA,质粒DNA,大肠杆菌细胞,质粒的改造构建,删除非必需区,：,减小质粒的分子量，提高外源DNA的装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细胞),加入新的遗传标记基因,。,引入具有多种限制酶识别及切割位点的DNA序列：,即多克隆位点(multiple cloning sites，MCS)。,插入特殊的基因表达调控序列。,PBR322 由大肠杆菌源质粒Col El衔生的质粒pMBl作为出发质粒构建而成含有Col El复制起始位点(Col-ori)，能在大肠杆菌细胞中高拷贝复制。,蓝藻穿梭质粒载体,穿梭载体（shuttle vector）,:是指在两种不同的生物中复制的载体。,蓝藻穿梭质粒载体：,既有大肠杆菌质粒载体必备元件，还含有蓝藻的复制起始位点。,农杆菌Ti质粒,致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含有一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引发植物产生肿瘤(冠瘿瘤)，所以称此质粒为 Ti 质粒(tumor in-ducing plasmid),几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒，即 2m质粒；,构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体，一般也构建成穿梭质粒载体，含有 2m 质粒的复制起始位点和大肠杆菌源质粒的复制起始位点。,含义,以病毒（噬菌体）,DNA,或,cDNA,为主构建的克隆载体，或者通过转染直接进入宿主细胞，或者包装成病毒颗粒后通过转导进入宿主细胞。,种类,噬菌体克隆载体：,噬菌体克隆载体,Cosmid,载体,植物病毒克隆载体：,CaMV,克隆载体,动物病毒克隆载体：痘苗病毒载体,腺病毒载体,反转录病毒克隆载体,2、病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体,DNA在噬菌体中以线状双链 DNA分子存在，全长 48 502bp。其左右两端各有 12 个核苷酸组成的 5凸出黏性末端(cohesive end)，而且两者的核苷酸序列互补，进入宿主细胞后，黏性末端连接成为环状 DNA 分子。把此末端称为,COS位点(cohesive end site),。,构建噬菌体克隆载体的策略,用合适的限制性内切核酸酶切去,DNA 上的部分或全部非必需区，相应保留这种酶的 1个或 2 个识别位点作为克隆位点，并用点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的这种酶的识别序列失效，避免外源 DNA片段插入必需区；,若有必要可在非必需区组人选择标记基因；,构建的,DNA 载体不应小于 364kb,入噬菌体载体 gtwes-B,粘粒（Cosmid）载体,组成：,质粒复制原点、抗药基因、多克隆位点、已连接入的DNAcos位点；,包装范围：,29.9-45kb大片段；,用途构建基因组文库。,痘苗病毒载体示意图,3 人工染色体载体大DNA片段克隆载体,（1）,含义,：,指能在宿主细胞中稳定地复制并准确,传递给子细胞的人工构建的染色体。,（2）,特点：,能容纳长达 1000kb以上的外源DNA片段。,（3）用途：,构建基因组文库,克隆和转移完整的高分,子量基因,基因功能鉴定,基因治疗,（4）类型：,线形的人工染色体：,必须含有端粒、着丝粒和,复制起始区。,包含：酵母人工染色体（,YAC),人类人工染色体（,HAC),哺乳动物人工染色体（,MAC),环形的人工染色体：,不需要端粒和着丝粒，但必须,含有合适的复制起始区。,包含：细菌人工染色体,(BAC),源于噬菌体1,的人工染色体,(PAC),双元细菌人工染色体,(BIBAC),可转化人工染色体,(TAC),三、目的基因,（一）定义：,目的基因含义：指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段，能编码某一产物或某一性状。,（二）来源：,来源于各种生物，其中主要是真核生物如人和动物。,基本步骤：,a.从供体基因组DNA产生适当大小的DNA片段,b.在体外将这些DNA片段同适当的噬菌体连接成重组分子,c.转化到大肠杆菌的受体细胞中去,d.从转化子克隆群体中挑选出含有目的基因的片段。（方法同从cDNA基因文库中获得目的基因）,四、受体细胞,1、含义：,所谓基因克隆的受体细胞，从实验技术上讲是能摄取外源DNA（基因）并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。,2、种类：,原核生物细胞、植物细胞和动物细胞可以作为受体细胞，但不是所有细胞都可以作为受体细胞。最好的是原核生物细胞。,原因：,大部分原核生物没有纤维素组成的坚硬细胞壁，便于外源DNA的进入,没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少麻烦,基因组小，遗传背景简单，并且不含线粒体和叶绿体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析,原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快,第三节 基因工程技术路线,目的基因的获得分离目的基因）,目的基因和载体的连接DNA重组,重组DNA导入受体细胞,筛选与鉴定克隆子（目的基因）,目的基因表达,一、分离目的基因的途径,1、,利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因,PCR扩增含目的基因DNA示意,2、利用PCR直接扩增目的基因,PCR技术是基因扩增技术的一次重大革新-1985年美国Cetus 公司的Millis等研制，于1993年获诺贝尔化学奖。,什么是PCR（,聚合酶链式反应）,即在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。,所用的仪器是PCR仪。,（1）PCR的原理：,PCR技术的原理并不复杂，实质为体内DNA复制的体外模拟。当双链DNA变性为单链后，DNA聚合酶以单链DNA为模板，并利用反应混合物的四种dNTPs，以与模板互补的核苷酸为引物，合成新生的DNA互补链。,PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的基因或DNA片段，并能很容易地使微微克（pg）水平的起始物达到微克（g）水平的量。,现已发展成为生命科学实验室获取某一目的DNA片段的常规技术，并逐渐被应用于各个领域。,20-35 cycles,72,5-7 min,4,12 h-更长时间,72,1-3 min,94 -96,0.5-1 min,92 -96,4-6 min,60 -37,0.5-1 min,变性使双链变为单链,退火使复性-引物与模板DNA结合,Tac聚合酶使延伸,PCR扩增的步骤,（2）PCR反应体系,水 18(,l),dNTP（原料）2,Primer1（引物）0.5,Primer2（引物）0.5,DNA分子（模板）1,Mg2+（酶的辅助因子，10buffer）2.5,Taq酶（DNA聚合酶）0.5,总体积 25,l,（3）PCR的特点,灵敏度高,PCR,产物每轮循环增加一倍，,30,轮循环扩增量达,2,30,个拷贝,特异性强,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。,引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性,同时尽可能减少非特异性扩增。,简便、快速、重复性好,一次性加好反应液，2-4小时完成扩增,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,3、目的基因的合成,实际上是DNA片断的化学合成，不同的是组成基因的DNA片段一般比较长，是将化学合成的200bpDNA片段采用全片段酶促连接法等组装成为含完整目的基因的DNA片段。步骤：,合成引物,合成DNA寡核苷酸连杆,合成基因片断,DNA片断的连接重组，采用DNA片段的连接酶有E.coli DNA、T4DNA连接酶,3、目的基因的化学合成,4、通过构建基因组文库或cDNA文库分离的基因,首先构建基因组文库或,cDNA,文库；,再从,cDNA,基因文库中获得目的基因。,含义,cDNA（complementary DNA)指由mRNA通过反转录酶进行反转录而成。,cDNA（complementary DNA)文库,：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，储存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称为cDNA文库。,基因组文库（gene library(bank),genomic library):,是指将真核生物的染色体组或原核生物的基因组切成许多片段，分别连接到载体（噬菌体或粘粒）上，经体外包装，侵染大肠杆菌后形成的克隆群体。它包含某一生物的全部或大部分染色体组，其中的每一克隆仅含有某一生物基因组的一个片段。,构建cDNA文库,构建基因组文库,从基因组或cDNA文库中获得目的基因,根据目的基因已知核苷酸序列进行筛选：,用已知的核苷酸序列制成核酸探针，对cDNA基因文库的一系列克隆子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因(后面介绍),根据目的基因特异性表达进行分离：,有的基因只有在某生物的特定生长发育阶段或特定的器官中才能表达,二、DNA片段和载体的连接,重组体DNA,1、载体的选择和构建,如质粒、温和噬菌体等，,选择：根据实验的目的来选择。如果要获得大量的高纯度的DNA片段，则选具有高拷贝的质粒载体：ColE1、PMB1、PMB9等松弛型复制子质粒。,2、载体与目的基因的链接（DNA连接酶）,3、DNA重组类型,插入重组：,即外源DNA插入到另一DNA分子中。外源DNA的两末端与接受载体的DNA（只有一个识别位点）两末端都相同，且会产两种重组DNA分子。,置换重组：,每种重组DNA分子中，对于接受外源DNA片段来说，部分序列已被外源DNA片段置换，因此称为置换重组。外源DNA的两末端与接受载体的DNA（有两个识别位点）两末端都相同，会产4种重组DNA分子。,三、重组体DNA导入受体细胞,受体:原核生物细胞、真核生物细胞,原核生物细胞：大肠杆菌,真核生物细胞：酵母,导入方法：目前有很多种方法，但采用哪一种应根据选用的载体系统和受体细胞类型而定,1、外源DNA转化方法,通过生物学、物理学和化学等方法使外源裸露 DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化三、重组DNA分子导入受体细胞,主要包括以下几种方法：,直接转化法,化合物诱导转化法,结合转化法,电穿孔转化法,微弹轰击转化法,激光微束穿孔转化法,超声波处理转化法,脂质体介导转化法,体内注射转化法,花粉管通道转化法,精子介导法,磷酸钙转染法,2、病毒(噬菌体)颗粒转导法,用病毒(噬菌体)的 DNA（或cDNA）构建成重组DNA，在体外包装成重组病毒(噬菌体)颗粒，通过感染使重组DNA进入受体细胞。,方式：,重组病毒直接感染受体细胞,重组病毒同另一辅助病毒一起感染受体细胞,重组病毒感染互补型受体细胞系,适用：,主要用于基因组文库或,cDNA,文库的构建和动植物的转基因。,四、筛选与鉴定克隆子（目的基因）,基本概念：,克隆子：通常将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称克隆子。也叫转化子。,重组子：含重组DNA分子（含目的基因）的克隆子称重组子。,（一）克隆子的筛选方法：,1、根据载体选择的,标记基因,筛选转化子,方法：将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一段时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。,1、根据载体标记基因筛选转化子,根据载体抗菌素抗性基因筛选转化子,根据载体除草剂抗性基因筛选转化子,根据,LacZ,基因互补显色筛选转化子,根据生长调节剂非依赖型筛选转化子,根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛 选转化子,不含抗生素,含抗,生素,蓝白斑筛选,2、根据报告基因筛选转化子,报告基因：一个编码可被检测的蛋白质或酶的基因，即表达产物易被鉴定的基因。由于受体细胞内报告基因的表达，出现新的遗传性状，以次来识别被转化的细胞或未被转化的细胞。,条件：报告基因的表达产物应是便于检测、定量和灵敏毒高的基因，比如：,-葡萄糖酸苷酶基因（,gus,）,萤火虫荧光素酶基因（,luc,）,绿色荧光蛋白基因（,gfp,）,3、根据形成噬菌斑筛选转化子（不要求）,转导受体菌，在培养基上形成噬菌斑，未转导的受体菌继续正常生长。,1、根据重组DNA分子特征鉴定重组子,根据重组,DNA,分子大小鉴定重组子,根据重组,DNA,分子酶切图谱鉴定重组子,根据,PCR,扩增片段鉴定重组子,采用,DNA,分子杂交法鉴定重组子,应用芯片鉴定重组子,根据,DNA,序列鉴定重组子,（二）重组子的鉴定,2、根据外源基因转录产物mRNA鉴定重组子,根据,RT-PCR,扩增片段鉴定重组子,采用,RNA,分子杂交法鉴定重组子,Northern,印迹杂交法,斑点印迹杂交,菌落（或噬菌斑）原位杂交,3、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子,蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子,单向凝胶电泳,双向凝胶电泳,毛细管等电点凝胶电泳,免疫检测法鉴定重组子,酶联免疫吸附法,Western,印迹法,固相放射免疫法,免疫沉淀法,质谱分析法,样品（DNA RNA 蛋白质）,转移到,尼龙膜,探针制备,杂交,放射自显影或显色观察,杂交的基本程序：,Southern杂交,Northern杂交,Western 杂交,探针与样品结合以检测样品中是否存在与探针具有同源性的核酸分子或与特异性的蛋白质存在的过程,分子杂交的原理:,（1）碱基互补原则（DNA、RNA）：根据两条核酸单链中互补碱基序列能专一配对的原理，利用已标记的某核酸片段为探针，可以检测重组DNA分子中是否有与探针同源的序列。,（2）抗原抗体反应（蛋白质）：,抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。,Southern杂交:,用以检查重组DNA中目的基因的存在。,Northern杂交,：用以分析特定目的基因的转录情况及不同组织器官中基因的差异表达。,Western 杂交,：用以检测目的基因的翻译表达情况及特定蛋白的组织特异性表达。,（五）目的基因的表达,目的基因在插入载体后，在其编码顺序的5端有能被受体细胞识别的启动基因顺序及能和核糖体结合的顺序。则该目的基因就可以表达，从而使是基因工程得以实现。,重组产物,目的基因,克隆载体,连接,重组DNA分子,细菌中原核表达,在植物中表达（转基因植物）,在酵母中表达,病毒中表达,分离纯化,上游技术,下游技术,酶切,酶切,转化感受态宿主细胞,目的基因被克隆,构建其表达载体,转化感受态宿主细胞,PCR和酶切鉴定,Southern,Northern,Western,鉴定,第四节 基因工程的应用与安全,有巨大潜力：,1、高效、经济,2、清洁、低耗、可持续发展,可遗传、易扩散、自主扩展,对人类伦理和人性尊严有直接影响,一、应用：,（一）基因工程应用于生命科学本身的研究,基因结构与功能研究,基因与疾病的关系,（二）基因工程与医药卫生,1）生产基因药品,2）基因诊断,3）,基因治疗,基因工程在医药卫生领域的应用,传统生产方法的缺点,由于受原料来源的限制，,价格十分昂贵,。,可利用什么方法来解决上述问题？,利用,基因工程,方法制造“,工程菌,”，可,高效率,地生产出各种,高质量、低成本,的药品。,在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素、生长激素等是直接从生物体的组织、细胞或血液中提取得到的。,1）生产基因药品,胰岛素是,治疗糖尿病,的,特效药,。一般临床上使用的胰岛素主要从,猪、牛等家畜的胰腺,中提取，每100kg胰腺只能提取45g胰岛素。用该方法生产的胰岛素,产量低,，,价格昂贵,，,远不能满足社会需要,。1979年，科学家将动物体内的,胰岛素基因与大肠杆菌DNA分子重组,，并在大肠杆菌内实现了表达。,每2000L培养液就能产生100g胰岛素！,1982年，美国一家基因公司用基因工程方法生产的胰岛素投入市场，售价降低了30%-50%。,基因工程药品,胰岛素,举例1：,胰岛素生产车间,胰岛素分子结构,干扰素是,病毒侵入细胞后产生,的一种,糖蛋白,。干扰素几乎能,抵抗所有,病毒引起的,感染,，是一种,抗病毒,的,特效药,。此外干扰素对,治疗,某些,癌症,和,白血病,也有一定疗效。,基因工程药品,干扰素,传统的干扰素生产方法是从人血液中的,白细胞内提取,，每300L血液只能提取出1mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在,大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素,，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。,举例2：,干扰素分子结构,干扰素生产车间,基因工程人干扰素-2b（安达芬）是我国第一个全国产化基因工程人干扰素-2b，具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。,治疗侏儒症,的,唯一方法,，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部,摘取垂体,，并从中提取生长激素。,基因工程药品,生长激素,现可利用基因工程方法，将人的,生长激素基因导入大肠杆菌,中，使其生产生长激素。人们从 450 L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,举例3：,其它基因工程药物,人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。,人造血液及其生产,基因诊断：,也称为DNA诊断,或,基因探针技术,，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。,2）基因诊断,原 理：,利用DNA分子杂交原理,；,基因探针技术：,探针制备：,放射性同位素(如,32,P)、荧光分子 等标记的DNA分子,；,基因探针：,基因探针就是一段与目的基因或DNA互补的,特异核苷酸序列,。它包括整个基因，或基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。,基因诊断技术在什么方面发展迅速？,在,诊断遗传性疾病,方面发展迅速。目前已经可以对几十种遗传病进行,产前诊断,。,1）-珠蛋白的DNA探针 镰刀状细胞贫血症,2）苯丙氨酸羧化酶基因探针 苯丙酮尿症,3）白血病患者细胞中分离出的癌基因制备的 DNA探针 白血病,举例,基因治疗：,是指是把,健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞,中，达到治疗疾病的目的。,3）基因治疗,体细胞基因治疗：,广泛使用。对象：基因变异或基因缺失的细胞。将有治疗功能的基因转入患者的某一特定组织中,生殖细胞基因治疗：,因能引起遗传改变而受到限制。当代-下一代，一旦出问题，造成严重后果。美国85年规定基因治疗仅限于体细胞,患半乳糖血症的患者，由于细胞内半乳糖苷转移酶基因缺陷而缺少半乳糖苷转移酶，使过多的半乳糖在体内积聚，引起肝、脑等功能受损。,1971年，美国科学家在体外做了试验，用带有半乳糖苷转移酶基因的噬菌体侵染患者的离体组织细胞结果发现这些组织细胞能够利用半乳糖了。这表明，用基因替换的方法治疗这种遗传病是可能的。,举例,SCID的基因工程治疗,重症联合免疫缺陷（SCID）患者缺乏正常的人体免疫功能，只要稍被细菌或者病毒感染，就会发病死亡。这个病的机理是细胞的一个常染色体上编码腺苷酸脱氨酶（简称ADA）的基因（ada）发生了突变。可以通过基因工程的方法治疗。,SCID患者生存在无菌环境中,基因治疗SCID的过程,基因工程在,农业上,的应用：,1）,高产,、,稳产,和具,优良品质,的品种,用基因工程的方法可以改善粮食作物的蛋白质含量。,“向日葵豆”植株,高光合作用基因转入普通杂交水稻产量可能提高20%,大豆蛋白基因转入水稻、小麦-高蛋白水稻、小麦,（三）基因工程与农牧业、食品工业,2）抗逆性品种,将细菌的抗虫、抗病毒、抗除草剂、抗盐碱、抗干旱、抗高温等抗性基因转移到作物体内，将从根本上改变作物的特性。如转基因抗虫棉。,转鱼抗寒基因的番茄,1、哈师大生物系研制,2、美洲拟蝶鱼抗寒基因,3、植株致死温度下降2度，Vc含量高15.5%，产量增11%,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,土传、细菌性病害叶片青干且不易脱落,抗虫棉,普通棉,科学家从,苏云金芽孢杆菌,中提取出,毒蛋白基因,，并成功的导入棉细胞内使之合成毒蛋白,。,特异性地毒杀棉铃虫及鳞翅目的一些其它害虫,繁殖具有,抗病能力、高产仔率、高产奶率,和,高质量的皮毛,等优良品质的,转基因动物,。,该过程的重要步骤是通过,感染,或,显微注射技术,将重组DNA转移到动物受精卵中。,人的干扰素基因、抗凝血因子基因、胰岛素基因转入奶牛-相当于生产工厂，可持久使用。,基因工程在畜牧养殖业上的应用主要是什么？,基因工程在,畜牧业,上的应用,用口径为1m的DNA,注射器,，将大量的目的基因片段注入到,受精卵的核,内，然后把经过注射的受精卵,移植,到另一只雌性动物的,子宫,内，使,受精卵发育,为转基因动物。,什么叫显微注射技术？,将大鼠的,生长激素基因,注射到小鼠受精卵中，得到的“,超级鼠,”。,转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快两到三倍，体积大一倍,这项研究被称为分子生物学技术发展史上的里程碑,生长快、肉质好的转基因鱼,(中国),生长速度比普通鱼提高，饵料利用率提高,用只小鼠进行了转全鱼基因 鱼食品消费安全试验，结果表明：转全鱼基因鱼作为食品消费是安全的。,乳汁中含有人生长激素的转基因牛。,(阿根廷),转基因动物的,乳腺细胞内,。,就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？,是指把人或哺乳动物的某种,基因导入,到,哺乳动物,(如鼠、兔、羊和猪)的,受精卵,里，,目的基因若与受精卵染色体DNA整合,，细胞分裂时，该基因随染色体的,倍增,而倍增，使每个细胞中都带有目的基因，使,性状得以表达,，并,稳定地遗传,给后代，从而,获得基因产品,。这样一种新的个体，称为转基因动物,。,什么叫转基因动物？,1）乳腺是一个外分泌器官，,乳汁不进入体内循环，不会影响,转基因动物本身的,生理代谢反应。,2）从乳汁中获取目的基因产物，,产量高，易提纯,，表达的,蛋白质已经过充分的修饰加工,，具有,稳定的生物活性,。,3）从乳汁中,源源不断,获得目的基因的产物的同时，,转基因动物,又可,无限繁殖,。,为什么动物的乳腺细胞能成为基因药物最理想的表达场所呢？,基因工程为人类开辟,新的食物来源,。,1）,鸡蛋白基因,在大肠杆菌和酵母菌中表达获得成功。这表明，未来能用发酵罐培养的大肠杆菌或酵母菌来生产人类所需要的,卵清蛋白。,2）用基因工程的方法,从微生物中获得,人们所需要的糖类、脂肪,和,维生素,等产品。,基因工程为食品工业提供了什么前景？,基因工程在,食品工业,上的应用：,1）用于环境监测；,2）用于被污染环境的净化。,基因工程在环保方面有什么应用？,例如：用DNA探针可以检测饮用水中病毒的含量。此方法的特点是快速、灵敏，1吨水中有10个病毒也能检测出来。,通过基因工程方法怎样进行环境监测？,（四）基因工程与环境保护,1t水中只有10个病毒也能被DNA探针检测出来,1）用基因工程产物“,超级细菌,”分解石油，可以大大提高细菌分解石油的效率。具体方法：将能分解三种烃类的,假单孢杆菌,的基因都转移到能分解另一种烃类的假单孢杆菌内，创造出了能同时分解四种烃类的“超级细菌”。,2）用基因工程培养出,“吞噬”汞和降解土壤,中,DDT,的,细菌,，以及能够,净化镉污染,的,植物,。,3）通过基因重组构建新的,杀虫剂,，取代生产过程中耗能多、易造成环境污染的农药，并试图通过基因工程,回收和利用工业废物,。,通过基因工程方法怎样净化被污染的环境？,(六)基因本身也是一个产业,Rockfeller 大学将人肥胖基因出售,0.2亿美元,（1995年3月）,Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达,3.29亿美元,（1997年）,Millennium公司以,4.65,亿美元,向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）,基因工程试剂的高回报,碱性成纤维细胞生长因子 231元/ug,红细胞生成素 1072元/ug,白细胞介素-2 410元/ug,巨细胞粒细胞集落刺激因子 1960元/ug,胰岛素 10.2元/mg,二、安全问题,（一）对生态环境的影响,（二）对人类健康的影响,（三）对伦理道德的影响,（四）所带来的经济问题,（一）对农业基因工程安全性管理,（二）对基因工程食品的安全性管理,（三）对基因工程医药产品的安全评价,三、安全性管理,思考题：,1、基因工程技术的发展给人类带来的影响？,2、基因工程技术在应用中存在的主要问题？,3、基因工程技术的发展方向？,