流式细胞术应用概述.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞术的一般介绍,流式细胞术在临床检测和科研中的应用,免疫学检测和科研应用,肿瘤学检测和科研应用,凋亡分析,血液学检测和科研应用,其它应用,主要内容,流式细胞术的一般介绍,第 一 部 分,什么是流式细胞术？,流式细胞仪(Flow Cytometer):,是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。,流式细胞术,(Flow Cytometry，FCM):,是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。,流式细胞仪特点,多参数测量和分析（散射光和荧光）；,快速测量和分析,每秒可达1000-10000个细胞,分选纯度可达99%以上。,获取的数据分析结果更具有统计学意义；,通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒,FACSCalibur,特点：,光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,使用寿命长,配备,1-2,根激光,细胞分选速度慢，,主要用于细胞分析,临床型（台式机）,流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构,细胞大小,细胞颗粒性程度,细胞表面面积,核浆比例,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,细胞功能,细胞表面蛋白抗原,细胞胞浆内蛋白性抗原,细胞内细胞因子,细胞增殖,细胞内钙离子浓度,流式细胞仪分析数据常见图形：,直方图(,Histogram,Plot),适用于：,单参数分析,仅需要观察某个荧光强度的变化,流式细胞仪分析图谱,SSC（侧向散射光）-反应细胞内颗粒多少,FSC（前向散射光）-反应细胞大小,散射光信号,特征信息荧光（Fluorescence）信号,FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）,FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）,FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等,PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）,流式细胞仪分析图谱,双色直接染色,设门：选择要分析的细胞群体,设定阴性、阳性范围,流式细胞术在临床检测和科研中的应用,第 二 部 分,一、免疫学检测和科研应用,1、细胞表面分子标记,（以淋巴细胞亚群检测为例）,原理,人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤细胞。,T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4,和CD8,T细胞两个亚群；,B淋巴细胞特异性标志为CD19；,NK自然杀伤细胞表达CD56或CD16，并且不表达CD3,利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合，再配多色荧光染料，即可以把淋巴细胞区分为各种亚型。进而得到各亚群的比例。,T,淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测：,T cells,T subsets,NK cells,B cells,淋巴细胞亚群及功能,T淋巴细胞(CD3+),名 称,功 能,CD3+CD4+,辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti),辅助和诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD4+CD29+,CD3+CD4+CD29-,辅助性T细胞(Th),诱导性T细胞(Ti),辅助细胞免疫和体液免疫,诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD8+,抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc),抑制免疫反应/杀伤异源细胞,CD3+CD8+CD28-,CD3+CD4+CD29-,抑制性T细胞(Ts),杀伤性T细胞(Tc),抑制细胞和体液免疫,细胞毒性T细胞,CD3+CD4+CD8+,活化的T细胞,在T细胞恶性增生时升高,CD3CD4-CD8-,表达,/,T细胞受体(TCR,/,),CD4+/,CD8,+比值,CD45RA+CD45RO-,幼稚的/静止的T淋巴细胞,当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低,CD45RA-CD45RO+,记忆性T淋巴细胞,病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低,CD45RA+CD45RO+,活化的T细胞,感染时升高,感染时升高,CD4+CD25+CD127-/FoxP3+,调节性T细胞（Treg),具有免疫抑制作用,CD4+CD25+CD127-Treg检测,活化T淋巴细胞,名 称,功 能,CD3+HLA-DR+,活化T细胞,CD4HLA-DR+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,CD4+CD25+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+CD25+,CD8+CD38+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差,B淋巴细胞(19+),CD19+CD23+,活化的B细胞,过敏患者中升高,CD19+CD5+,在自身免疫性疾病中升高,CD19+CD5+CD23+,慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞,NK细胞,CD3+CD(16+56)+,自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高,CD3+CD57+,CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆,淋巴细胞亚群及功能,淋巴细胞亚群与疾病,疾 病,CD3,CD4,CD8,CD4/CD8,NK,自身免疫性疾病,系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,自身免疫性溶血性贫血,重症肌无力,免疫缺陷病,爱滋病,病毒感染,传染性单核细胞增多症,慢性活动性肝炎,活动性肝硬化,肿瘤,消化道癌,肝癌,肺癌,再生障碍性贫血,粒细胞减少症,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥,CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染,2C,G2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C,1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平,2、性细胞DNA含量为1C,3、处于增殖期至分裂期细胞由,2C增加至4C,4、凋亡细胞DNA断裂,含量2C,细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量,Diploid:100.00%,Dip G1:54.38%at 46.90,Dip G2:15.91%at 91.61,Dip S:29.71%G2/G1:1.95,%CV:5.23,G0/G1,S,G2/M,Diploid:64.50%,Dip G1:92.45%at 49.24,Dip G2:2.30%at 98.48,Dip S:5.26%G2/G1:2.00,%CV:3.21,Aneuploid 1:35.50%,An1 G1:97.69%at 58.53,An1 G2:0.00%at 123.89,An1 S:2.31%G2/G1:2.12,%CV:3.14 DI:1.19,可检测标本,新鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。,冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织,常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。,通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。,蜡块包埋的标本需进行特殊处理,意义,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1.Ross JS.DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology.New York:Igaku-Shoin;1996:47-60,DNA,倍体和S期比例-指导治疗2,卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症,-早期 (I/II期),DNA,倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2,卵巢癌-晚期,2.The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry.HCFA Website,1999,2、肿瘤相关基因编码蛋白检测,P53,乳腺癌,与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃 癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞,淋巴,单核细胞等,受激素或生长因子调节的腺上皮,前列腺上皮,子宫内膜等,干细胞或增值细胞,皮肤的基底细胞,肠上皮,寿命长的分裂细胞,神经元,胚胎组织,Bcl-2在肿瘤组织中的表达,肾脏肿瘤,肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤,前列腺癌,B细胞性淋巴瘤,乳腺癌(43%),甲状腺癌,nm23,nm23与多种肿瘤的转移及预后相关,肝细胞癌,甲状腺肿瘤,乳腺癌,结肠癌,肉瘤,CD44,(CD44s/CD44v),3、Cyclin(细胞周期蛋白)检测P-gp在肿瘤组织中的表达,乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等,化疗前高表达,化疗后高表达,肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等,化疗前低表达,非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等,化疗不敏感,化疗敏感,化疗不敏感,4、肿瘤多药耐药性(MDR)检测,4、凋亡检测,详见下一部分,三、,流式细胞术分析凋亡,细胞凋亡与疾病的关系 该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说,无论凋亡过度或凋亡不足,都可以导致疾病的发生。,细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病,细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元,退行性疾病，病毒感染,不足与过度并存：动脉粥样硬化,凋亡与疾病细胞凋亡过程,在凋亡诱导因素的作用下,线粒体的膜电位改变,caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,DNA断裂,形成凋亡小体,凋亡的检测方法,1.形态学检测,光学显微镜,荧光显微镜,(Hoechst 33342，Hoechst 33258,DAPI),电子显微镜,2.磷脂酰丝氨酸外翻分析（可用FCM）,3.线粒体膜势能的检测 （可用FCM）,4.DNA片断化检测（可用FCM）,5.TUNEL法（可用FCM）,6.Caspase-3活性的检测（可用FCM）,7.凋亡相关分子的检测（可用FCM）,促凋亡分子:Bax,Bcl-Xs,Bak,Bad,Bid 等,抑凋亡分子:Bcl-2,Bcl-XL和bcr/abl kinase等,8.相关信号通路分子的检测（可用FCM）,1.磷脂酰丝氨酸外翻分析(ANNEXIN V标记法),【原理】,细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸,（,PS,）,外翻；,Annexin,-V,能与,PS,高亲和力特异性结合；,碘化丙啶,(,propidine,iodide,PI),可以区分活细胞和死细胞。,结果分析,结果分析-优,结果分析-差,如何获得好的结果,细胞状态要好；,细胞处理的火候问题：药物浓度、时间需要摸索；,染色后，不能固定细胞，应尽快检测。,2.线粒体膜势能的检测,【原理】,线粒体跨膜电位的下降，是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，一旦线粒体膜电位崩溃，细胞凋亡,则不可逆转。,线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,常用染料有：Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide DiOC6（3）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodideJC-1、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等,结果分析,3.DNA片断化检测,通过PI染色，分析亚二倍体峰（凋亡峰），方法同“DNA倍体分析和细胞周期分析”,4.TUNEL法,流式也能进行TUNEl检测，其检测原理与经典TUNEl原理基本一致。利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。,流式检测后，可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点，经典TUNEl是做不到的。,经典TUNEL法原理,结果分析,结果分析,结合细胞DNA含量分析效果更佳,5.Caspase-3活性的检测,Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子。,Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。,用荧光标记的抗活化Caspase-3的抗体进行胞内染色，可以通过流式细胞术分析其活性,在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降,四、,流式细胞术在血液学中的应用,1、,流式细胞术白血病免疫分型,白血病细胞起源、分化和生物学行为不同，构成了白血病的异质性，因此急性白血病的全面、正确分型是准确、及时治疗的前提。急性白血病的分型基本上分三个阶段：,FAB分型,(1976),(morphology，M),MIC分型,（1986）,(morphology，M),(immunology，I),(cytogenetics，C),WHO分型,(2001),（MICM）,(morphology，M),(immunology，I),(cytogenetics，C),(molecular biology,M),急性白血病分型历史,急淋,（ALL）,急性白细胞FAB分型,急非淋,（ANLL）,急性髓细胞白血病(AML),L1型,L2型,L3型,M0:微分化型髓系白血病；,M1：未分化的原粒细胞白血病；,M2：部分分化的原粒细胞白血病；,M3：急性早幼粒细胞白血病；,M4：急性粒、单核细胞白血病；,M5：急性单核细胞白血病；,M6：急性红血病或红白血病；,M7：急性巨核细胞白血病。,MIC分型,以形态学为基础、免疫学和细胞遗传学作补充，相互结合，使分型更趋精确。其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。,MIC分型,形态学,(morphology，M)：传统的骨髓片检查,免疫学,(immunology，I )：免疫组化 流式细胞术,细胞遗传学,(cytogenetics，C)：染色体分型,利用荧光素标记的单克隆抗体鉴定细胞表面或细胞内的免疫标志，可准确反映白血病细胞的所属系列（TB髓）及分化程度。,检测分析时，首先根据CD45表达强弱和细胞颗粒度，在CD45-SSC图中确定幼稚或异常的细胞群体。然后分析检测各种标志的表达情况及其阳性率。,白血病免疫分型原理,流式细胞术白血病免疫分型优点,细胞形态学，免疫学和细胞遗传学三者相结合是当今公认的白血病分型方案，其中免疫学分型是另外两种方法的重要补充。流式细胞仪可方便、快速、准确地完成白血病的免疫学分型，其意义在于：,准确寻找和计数幼稚或异常的细胞群体；,用形态学、细胞化学染色不能肯定细胞来源的,白血病,；,形态学为急性淋巴细胞,白血病,（,ALL,），但缺乏特异性淋巴细胞系列抗原标记；,混合性,白血病,；,帮助确定髓系白血病所属类型；,慢性淋巴细胞,白血病,/,淋巴瘤；,微小残留,白血病,。,CD4、CD8、CD61、CD56、CD38,本实验室现有的白血病免疫分型抗体组合,CD3CD79aMPO,可以确定白血病分别属于T/B/髓系,表面染色,胞内染色,T系：CD2CD5、CD7,B系：CD10、CD19、CD20,髓系：CD11b、CD13、CD14、CD15、CD33,非系列特异的抗体：,CD34、HLA-DR,全套,进一步细分,其它,必要时可以加用,泛白细胞标志：CD45,标本来源,（1）外周血,（2）骨髓穿刺液，,（3）骨髓活检标本,（4）淋巴组织穿刺,样本保存,要 求：,室温条件(16,-28,)存放；,如非液态标本，则要在标本中加入足量的等渗液体（如 生理盐水或组织培养液）。,保存时间,肝素抗凝的外周血和骨髓标本，存放时限为4872小时；,EDTA抗凝标本，存放时限只有12 24小时，因为髓细胞在此条件下会裂解；,柠檬酸（ACD）抗凝的外周血标本可存放72小时以上。但此方法不推荐用于骨髓穿刺标本，因为高浓度的ACD会引起pH值变化而导致骨髓细胞死亡,正常骨髓流式分析图,CD45/SSC,图中可见：,CD45,强阳性,SSC,低信号的细胞群为淋巴细胞(褐色细胞群体),中等强度的,CD45,表达,SSC,信号最强的细胞群体为粒细胞(蓝色及红色细胞群体),CD45,表达与,SSC,信号介于淋巴细胞与粒细胞之间的是单核细胞群体(绿色细胞群体),CD45,阴性,SSC,信号最低的有核红细胞和细胞碎片,根据骨髓细胞,CD45/SSC,图中分布情况设门圈定各类细胞,R1,门为成熟淋巴细胞,R2,门为正常单核细胞位置,R3,门正常粒细胞位置,R4,门为幼稚淋巴细胞出现位置,R5,门为有核红细胞或细胞碎片位置,R6,门为幼稚髓细胞出现位置,白血病细胞通常会在,R4 R6,两门位置处出现,举例,B-ALL,CD19、CD20、CD10、cCD72、CD34、HLA-DR阳性,M3:,CD13和/或CD33阳性，CD15阳性，CD34、HLA-DR、CD14阴性，偶尔表达CD2。MPO阳性。,混合表型,目前急性白血病的分类仍较复杂，,流式细胞术免疫分型能提高分型的准确性，但不是疾病的诊断,。,理想分类法应该以形态学为基础，结合免疫学和细胞遗传学、分子生物学提供信息。,国际血液学家及血液病理学家2001年3月里昂会议上的造血和淋巴组织肿瘤的WHO分类法，应用MICM分类技术力求反映疾病本质，成为国际上一种新的分类标准。,白血病免疫分型总结,2、,流式细胞术多发性骨髓瘤免疫检测,正常浆细胞与骨髓瘤细胞在免疫表型上存在明显差异，前者为,CD38+CD19+CD56-,，而后者则为,CD38+CD19-CD56+/-,。,此外，,B,系的其他标志（如,CD10,、,CD20,等），非,B,系标志（如,CD2,、,CD5,、,CD7,、,CD13,、,CD33,、,CD34,、,HLA-DR,、,CD14,等）在骨髓瘤细胞中也可能有异常表达。,因此，通过多参数流式细胞术，进行多种表面标志标记，可以很方便地区分正常浆细胞和骨髓瘤细胞，对,MM,的诊断和预后判断有重要价值。,【原理】,3、网织红细胞血小板检测,计数外周血中检测网织红细胞和网织血小板,4、血小板自身抗体检测,血小板自身抗体检测：血小板自身抗体识别人血小板抗原，会引起各种临床相关症状，如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少。,血小板活化实验,活化标志：,CD62P,（,P,选择素）、,PAC-1,（,IIbIIIa,复合物）,血小板特异性标志：,CD61,5、血小板功能分析,6、夜间阵发性血红蛋白尿,正常人,CD55,和,CD59,表达完全阳性。,PNH,表达分三型（以,CD59,为例）：,I,型，,CD59,表达完全阳性，荧光强度同正常人；,II型，,CD59,表达部分阳性，荧光强度介于,I,和,III,型之间；,III,型，,CD59,表达完全阴性。,7、造血干细胞检测,干细胞的特征,细胞特征,祖细胞的流式细胞仪特征,CD34表达,对CD34的反应性：强,CD45表达,对CD45的反应性：弱阴性,DNA/RNA含量，核酸染料摄取量,祖细胞DNA/RNA含量较多，染色性较强,大小（前向散射光）,祖细胞直径约810m，与大淋巴细胞前向散射光位置相同，也可能伸入单核细胞区域。,粒度（侧向散射光）,祖细胞的侧向散射光弱，与淋巴细胞、大淋巴细胞相似。,CD34,、,CD45,与核酸染料联合应用，通过合理的设门策略才能够准确检测,CD34+,干细胞比例；,也可以用相关试剂盒进行绝对计数,五、,流式细胞术在科研中的其它应用,1、流式细胞术检测吞噬细胞的吞噬活性,吞噬细胞,小吞噬细胞,大吞噬细胞,中性粒细胞,单核细胞,单核细胞巨噬细胞,中性粒细胞,举例流式细胞术检测中性粒细胞吞噬功能,荧光素标记细菌,中性粒细胞吞噬荧光素标记的细菌,快速、客观、重复性好,大肠埃希菌,金葡菌,85.54,45.61,54.95,93.64,40.45,53.10,88.75,93.86,5min,10min,15min,20min,表示表示37 吞噬率,-,表示0 15min吞噬率。,人PMN吞噬荧光素标记细菌的时间动力学流式分析图,Cayman吞噬功能检测试剂盒,（可采用流式细胞仪或荧光显微镜等检测）,分析PMA刺激增加THP-1细胞株的细胞吞噬功能,方便！直观！快速！,细胞吞噬功能涉及多发性硬化、Alzheimer、动脉粥样硬化，细菌，霉菌等众多疾病的研究，是细胞功能变化的一个重要方面。,pHrodo 噬菌作用流式分析试剂盒（100 assays）,快速标记生物微粒，用于细菌和全血的噬菌作检测。,2、免疫细胞细胞毒活性流式检测,细胞毒活性检测方法,MTT,法,3,H-TdR,摄入法,流式法,CFSE/PI,双标记法,实验原理,1.羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(,CFDA-SE、CFSE,),是一种膜通透性的荧光素染料，能与胞内蛋白中的氨基反应形成稳定的染料蛋白加合物（绿色）,2.碘化丙啶,(,PI,),是一种膜非通透性的荧光素染料，不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色（红色）,3.靶细胞先行,CFSE,染色，然后将效应细胞和靶细胞以一定的比例作用一定时间以后，加入,PI,，流式细胞仪检测，,CFSE,/PI,双标记的细胞即为死亡的靶细胞。,3、流式细胞术CFSE染色分析细胞分裂增殖,Divisions:,3 2 1 0,CFSE,FL-1(Log),Divisions:,3 2 1 0,实验原理,Calculating precursor frequency,01590/11590,11140/2570,21388/4347,3687/886,441/162.6,Total;2595,Cohort Total;1005.6,%original cells dividing is 1005.6divided by(2595+1005.6)=38.7%,Lyons(2000)J.Imm.Meth.243,147,Parent:1.22%at 200.00,Generation 2:2.83%at 180.81,Generation 3:5.67%at 161.62,Generation 4:8.48%at 142.43,Generation 5:7.31%at 123.24,Generation 6:18.99%at 104.05,Generation 7:35.96%at 84.86,Generation 8:19.43%at 65.67,Generation 9:0.00%at 46.48,Generation 10:0.12%at 27.29,Upper Generation P.I.:22.63,Precursor Frequency:0.616768,Number of Cells Analyzed:2989,Reduced Chi-Square:0.981,ModFit软件可以自动分析和计算,4、,流式微球分析,Cytometric Bead Array（CBA）,CBA与ELISA相比优点,“多元”和“同步”检测,样本量少,灵敏度相似,稳定性好,Cytometric Bead Array,结果举例,本室已有的流式细胞术检测平台,HLA-B27,流式检测,淋巴细胞亚群流式检测,血小板抗体流式检测,造血干,/,祖（,CD34+,）细胞流式检测,活化,T,细胞（,CD3/HLA-DR/CD25,）流式检测,活化单核细胞,(CD14/HLA-DR),流式检测,调节性,T,细胞（,Treg,）流式检测,白血病流式免疫分型,多发性骨髓瘤流式免疫分型,DNA,倍体和细胞周期分析,Thank You,