淋巴细胞分离与培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,淋巴细胞分离与培养技术,淋巴细胞作为血液中白血胞的主要组成成分，是动物机体完成细胞免疫和体液免疫的重要基础，为抵抗外来侵害提供了完善的免疫防护机制。同时，淋巴细胞还具有寿命长，激活后可分裂、增殖的特性，因此很适合于离体培养，为免疫学研究带来极大的方便。另外，利用体外培养的淋巴细胞进行抗癌研究、爱滋病治疗、新药研制已屡见不鲜。,一、淋巴细胞分离,1、分离原理,人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高，纯度较好，失活较低，根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可根据细胞的物理性状和表面标志设计。,密度梯度离心法,其原理是：人外周血中各种细胞的密度不同，人红细胞密度为1.093，粒细胞为1.092，淋巴细胞为1.0740.001。密度梯度离心法的原理主要根据各类血细胞比重的差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立带，从而达到分离的目的。,2、方法,(1)采静脉血2ml 加入肝素抗凝管,(2)用竹签将血块轻轻剥离管壁（主张用玻璃棒），2000rPm 离心20 分钟，用毛细吸管吸取上清（血清）于血清收集管中，于4冰箱保存备用，,3将装有静脉血2ml 加入肝素抗凝管（或枸橼酸钠）轻轻摇动使血液与抗凝剂混匀，出现凝集不能继续实验。5min 后加入Hanks 液2ml(Hanks 液为缓冲等渗液，类似营养液，保持细胞活性及完整性，可抵抗轻微的酸碱变化)，手动轻轻摇匀。,4用毛细吸管吸取抗凝血，将抗凝血全部沿管壁缓慢加至另一含2ml 淋巴细胞分离液液面上，注意保持两种液体界面清晰。,【难点】,1将抗凝血与Hanks 液的混合液加入淋巴细胞分离液时，必须保持两种液体界面清晰。,2用毛细吸管吸取淋巴细胞层时，要掌握好力度，在细胞层上作各个方向的吸取，勿吸到其它层的液体或细胞，吸取时勿使各层细胞相混。,二、淋巴细胞培养,1、原理,通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。,2、实验准备,1.实验器材：,超净工作台、37恒温培养箱、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75酒精棉球、止血带、离心机、定时钟、试管架、手术镊子,2.实验材料：,人外周静脉血（肝素抗凝）,3.试剂,抗凝剂：肝素溶液（500U/ml）,培养基：RPMI1640,按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。,小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56水浴条件灭活。,植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用,抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制。培养液中的终浓度均为100 U/ml,5%NaHCO3,3、实验步骤,（1）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；,每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：,RPMI1640 4ml,灭活小牛血清 1ml,PHA 2.5mg,青霉素 500U,链霉素 500ug,依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO3调节培养基的pH值至7.2-7.4。,（2）血样本的采集：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素,（3）接种：常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台，在火焰旁将血液滴入23个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.20.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37恒温箱内静置培养72h。,4、注意事项,（1）,pH 值,细胞生长的最适pH 为7.07.2,可忍耐的pH 范围为6.67.8,当pH 低于6.8 或大于7.6 时都会抑制细胞生长。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0.20.4,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7.2比较合适,并且需经常检测pH 值。,（2）,培养空间,培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以110 为宜,培养液液面高度最好维持在25mm 的范围,以便于气体交换。,（3）恒温培养箱,温度应维持在37,CO2 浓度为5%,O2 为95%,100%的饱和湿度。,5、,常见失败原因,(1)污染,污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。,(2)pH 值过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。,(3)诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)白细胞介素2(IL-2)、植物血凝素(PHA)、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。,(4)培养器皿洗涤不干净有蜡、油污或酸残留。,(5)培养用液含有杂质配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖。,(6)接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞。,(7)血清质量不佳。,(8)恒温培养箱的CO2、温度等不稳定。,(9)存在个体差异在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。,三、永生淋巴细胞株的建立,为保留遗传病标本，用继代培养或病毒转化方法可使很多类型的细胞数量倍增，如皮肤成纤维细胞、脐静脉内皮淋巴细胞是分子与细胞遗传学研究中常用的材料,但由于其寿命很短,而且由于许多原因难以再次获得病人或有重要研究价值个体的血液标本,给临床诊断和进一步的深入研究带来一定困难。并且随着这些个体的死亡,这些宝贵的材料就会永远丢失。细胞、干细胞、胶质细胞、肿瘤细胞如宫颈癌上皮细胞等。其中EBV转化淋巴细胞所建立的永生培养细胞库是最为成熟和标准化的。,EB病毒可有效地转化外周血B淋巴细胞,建立永生的淋巴母细胞系,可永久保存宝贵的病例材料。世界上许多遗传研究中心都用此方法处理每一份血标本，在液氮中冻存转化后的淋巴细胞。这样就可以无限期地保存、复苏和增殖病人体细胞样本，建立人类遗传种质库,淋巴细胞是EBV的天然宿主，EBV对B细胞有天然的亲和力并可使其发生转化并增殖。与通常在体外使用的B细胞活化剂引起的B细胞的暂时的一过性分裂不同，EBV转化的淋巴细胞是一种非裂解型细胞：病毒感染后不能在细胞体内复制后代，但能整合在宿主细胞基因组上，一部分整合了病毒基因组的细胞发生转化,EBV、HPV等人疱疹病毒并不携带一整套诱导宿主细胞性状发生巨大变化的基因，它们只是启动与细胞转化有关的一系列事件的发生，而这些事件的发生需要细胞内蛋白质来实现。从某种意义上来说，这些病毒只是扳动了改变靶细胞生长特性的调控开关。它们的转化活性来源于病毒基因组中的某些特殊基因，就是癌基因。这些癌基因在病毒早期的裂解循环中，参与病毒颗粒的复制；当转化发生时，它们整合进入淋巴细胞的基因组中，持续表达癌蛋引起细胞无限制分裂等肿瘤样改变，遂形成淋巴母细胞系。,