浙江大学细胞工程第七章课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,胚胎工程,胚胎工程,（,embryo engineering,）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。,在研究过程中发现，低等动物的生存和发育环境相对比高等动物简单，材料易得，容易操作，因此研究成果较多。但由于哺乳动物的胚胎工程意义较低等动物大，因此本章将要介绍有关哺乳动物胚胎工程中的,配子操作,（,gamete manipulation,）和,胚胎操作,（,embryo manipulation,）。,7.1受精于胚胎发育,7.11,精卵发生7.12,受精,7.13,动物早期胚胎,发育及其分子机制,7.21,精卵发生和受精,哺乳动物的生殖是一个相当复杂的生命现象，在胚胎早期，生殖细胞首先与体细胞分离，形成的细胞为原生殖细胞(PGCs),其后，经过性别决定和将要进行的性别分化，形成两种生殖细胞。,生殖细胞经过增殖期、生长期和成熟期,最终形成精子和卵子。,卵子的结构,卵细胞内部物种空间结构排列具有,极性,，卵内组分沿着卵的主轴分布不均匀，形成,动物级,和,植物级,。卵黄积聚在植物级。,卵细胞分布在两个固定的区域，质膜下细胞质称为,皮层,，皮层是高度粘滞、半硬的凝胶状，内含有,皮层颗粒,和,色素颗粒,。大部,分卵细胞质,内质,是液体状态，内含,线粒体,和,生殖质,。,卵细胞排出卵巢后，有,卵膜,包被,卵子的发生,一个卵巢包含三个世代的卵母细胞，每年当一个世代的卵母细胞成熟后，就被新的世代所取代。,在哺乳类，所有卵原细胞成熟后和卵原细胞转变为卵母细胞是在,胎儿分娩前,完成。,卵母细胞形成阶段是,从胎儿诞生开始一直到性成熟排卵,为止。,直到青春期卵母细胞才进行生长，以后,每个性周期,后有一批新的卵母细胞继续发育，而多数卵母细胞在每个周期发育中未成熟就退化。,卵母细胞的成熟过程受,MPF(,成熟促进因子）,和,CSF,（细胞生长抑制因子）,的相互调节。,卵巢激素控制示意图,7.12,受精作用,1,）精子的成熟和获能,精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内,获能,，才具有使卵受精的能力。,在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋白，称为,去获能因子,，精液中的精子表面被覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生一系列变化。,2,）精子的行进,在正常生殖过程中，精子在阴道和子宫内的运动速度很快，十几分钟即达到输卵管，积聚在输卵管峡部下23cm处，在此停留十几到几十个小时，然后继续上行，只有少数精子可以达到卵管壶峡连接部，在此与刚排出的卵相遇，完成受精过程。,3,）顶体反应,定义：,精子在同卵子表面接触或与卵膜分泌的物质相遇后，精子的顶体就会发生一系列的变化。精子顶体帽部分的质膜和顶体外膜在卵的透明带卵丘及输卵管分泌物的作用下，在多处发生融合，因此在该部出现很多裂口，使得顶体内部的物质释放出来，包括各种水解酶，从而使它们在受精中起作用,4,）精卵融合过程,A 顶体反应后，精子穿过透明带进入卵周隙,B 以赤道段与卵质膜相融合,C 融合后CGs胞吐，核开始去致密,D 精子头部完全入卵，将一部分卵质膜带入。,5,）卵子的激活,精子一旦与卵子接触，卵子本身就开始发生一系列深刻的变化，即,卵子的激活,。,卵子激活时，皮层颗粒首先于接触点发生破裂，然后波及整个卵子的皮层，发生,皮层反应,。皮层颗粒内含物被排出，一部分与卵外的卵黄膜一起形成,受精膜,，防止多精受精。另一部分留在卵子和受精膜间的卵周隙中，吸收水分，结构使受精膜逐渐与卵子分开而举起。另外，皮层颗粒排放出的粘多糖形成一种粘性的透明膜物质，与卵表面紧密相粘，作用是保持随后的分裂球聚集在一起。,6),多精受精的阻止,1）透明带反应，在皮层反应后，由于皮层颗粒内物质释放到透明带表面，卵质膜发生了重组，破坏了精子受体，其它精子不能再与透明带结合。,2）皮质反应后产生受精膜。,7,）原核变化及融合,精子进入卵内后，精子核膨大，核膜由于泡状化而破裂，并分散在卵细胞质中，其中的染色质也由致密状态开始松散而成为颗粒或细丝状，逐渐形成,雄原核,。,卵子细胞核在完成两次减数分裂后，染色体首先分散，沿着分散的染色体的边缘汇集了一些小囊，逐渐融合形成一双层包膜，从而形成了一些内含染色体的小囊，即染色体泡。然后，它们相互接近，包膜彼此合并成为一个不规则的,雌原核,。,雌、雄原核移向卵的中央，相遇，核膜消失，染色体彼此混杂在一起，从而使配子的单倍体恢复成为合子的,双倍体,。受精完成。,人受精和胚胎发育全过程,7.13,动物早期胚胎发育及其分子机制,精子和卵子经过受精作用形成受精卵，受精卵经过卵裂、形成囊胚，囊胚进一步发育进入原肠胚阶段，形成不同胚层，再产生器官原基，进一步产生个体。,早期胚胎发育,卵裂：,合子发生分裂形成无数小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程桑椹胚：,卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名,胚泡：,哺乳动物的胚胎处于,16,细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。,囊胚：,桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层,原肠胚：,囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。,胚胎发育,哺乳动物胚泡着床,内细胞团：,在胚泡胚极一端，能够发育成为胚胎主体的一团细胞,滋养层细胞：,外层发育成为胎盘的细胞。,着床：,胚泡和子宫壁相互接触并侵入子宫组织的过程。,细胞质定域,细胞质的分布及其在子细胞中的分配并不是均匀的，有的物质在胞质中有一定的区域。在一定程度上决定着细胞的早期分化，这种特殊物质在受精卵中的特殊定位，以及卵裂时对各子细胞分配的不均匀性，即,细胞质定域,。,生殖细胞具有特殊的卵子细胞质，即,生殖质,，是生殖细胞的决定因素，它在卵子中位于一定部位，在卵裂中分离，进入生殖细胞。,早期发育的基因表达,胚胎发育初期是受母体基因组影响，依靠,卵原性基因,合成各种蛋白质，而由父、母本结合形成的胚胎基因组影响甚微。但继续发育，由于卵原性基因消耗殆尽，影响减弱，合子基因组则显出突出作用，不同动物,合子基因组,参与调控的开始时间也不同。,哺乳动物卵裂是,受卵原性转录本和合子基因组新转录本的共同调节,。,形态变化中的分子机制,形态变化的基础是细胞分化，而细胞分化又是由该细胞所接受的,位置信息,所决定的。位置信息是以位置值的形成赋予细胞的。,细胞根据所获得的位置值和自身其基因组所处的状态来表达适当的基因，其结果表现为细胞分化，同时伴随着某些新蛋白的合成。,同源异型基因,:,对躯体进行规划的调控基因，如果发生突变就可以使身体中的某个完整的体节或体节上某个完整的结构发生变化,7.2,配子操作,7.21,精子,7.22,卵母细胞,7.23,体外受精,7.21,精子,精液的采取方法通常有：,人工阴道法,、,电刺激法,、,阴道内回收法,等。,对于个体较大的动物多采用人工阴道法，而对于小动物而言多采用电刺激法采精。,人工阴道法,人工阴道法是由橡胶制造的双层圆筒，两层之间充以温水（,38,40,），后端有精液收集管以软橡胶膜袋与人工阴道相连。对于公牛而言，一般多应用台畜使爬上，将假阴道自侧面套在公牛阴茎上，使其射精。在公猪可以用猪用假阴道收集精液或用手握法采精，但仍需要台畜，使其爬上以遍进行操作。,另外，也可以用特制的电极，插到公畜的直肠内，根据不同畜种给予不同的电流刺激，经过不同的时间，即可射精而得到精液。,精液的保存,精液的保存可以分为常温（,15,25,）、低温（,0,5,）和超低温冷冻（,79,-196,）三种，其目的是要降低精子的代谢活动，延长其存活时间，尽量保存其受精能力保存前，要加稀释液，其成分按其作用可分为稀释剂、营养剂和保护剂等。,稀释剂,包括等渗氯化钠溶液和某些盐溶液，,营养剂,包括糖类、奶类和卵黄等，,保护剂,包括有抗冻作用的营养剂和其它一些如甘油、,DMSO,、糖类等。,三种保存方法,常温保存,主要通过降低,pH,值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存,2,天以上。,低温保存,主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。,如果应用,超低温,可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。,对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。,人为使得精子获能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。,而雌性生殖道获能没有种属特异性，因而可以由屠宰场取任何的动物的子宫或在实验室内取小动物的子宫给所需动物的精子获能。,另外，可以利用人工配制的培养液使得精子获能。,卵母细胞,人工采卵是得到卵母细胞的方法通常利用激素进行诱导采卵或超数采卵。可以利用促性腺激素或黄体激素释放激素（,LH,RH,），对小鼠、大鼠和兔子等动物进行一次性投与诱发其排卵，排卵数目不变。,以小鼠为例，通常可用,3,5IU PMSG,或,2,3IU hCG,或,100g FSH,或,100gLH,或,0.02,0.05g LH,RH,皮下或腹腔内注射，,12,14,小时可以有,70,100,正常排卵。,超数排卵,如果一次要获得多个卵，可以利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为,超数排卵（,superovulation,）,如在小鼠,期涂片相时注射,5,10IU PMSG,，,48,50,小时后，再于皮下或腹腔注射,5,10 IU hCG,，这种方法可以获得超数排卵。,人的人工采卵和超数排卵，要在月经期,5,9,天，每天给予,100,150mg,克罗米酚，,11,天或,12,天用,B,型超声检测卵巢表面的卵泡直径达到,20mm,时，再给予,4000,9000 IU hCG,，,32,40,小时后取卵。,采卵,输卵管内采卵：,以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大不，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。,对于稍大一些的动物可以用,活体输卵管采卵,，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下,1cm,处，剪成,V,形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。,采卵,3.,对于屠宰场中的大中型动物，可以用,注射器插入卵泡中抽取,，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。,4.,对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用,B,超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管,插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。,卵母细胞一般检测,得到卵母细胞后，可根据卵泡发育的不同时期，在显微镜下检查,核和胞质发育的状况,，如核的形态、位置和所处的时期。,排出的卵母细胞，有多层,卵丘细胞,包围，除去卵丘细胞后，可以见到卵周隙增大，内有第一极体，核处于第二次成熟分裂中期。,多数实验动物的卵母细胞胞,质呈透明状,，但由于胞质中,富含大量脂滴和空泡,，所以在镜下呈,暗色,。,各种不同的动物，按照不同的分类标准，卵的分类可以分为,优秀、普通、不良和异常卵,。,进行体外受精的卵母细胞，一般以卵丘卵母细胞复合体外面完整地包有,3,4,层卵丘细胞，卵母细胞胞质无斑块者为佳。,镜检卵母细胞,如果新鲜或固定后要作整体观察，可以取凡士林石蜡（,1,：,1,）融化后滴于载片中部四角，在镜下用微吸管自平皿中吸取卵母细胞，滴到,4,滴凡士林石蜡滴的中央，盖上盖片并轻压之，即可置于相差显微镜下观察。,如果要观察细节，需要染色、切片后观察。一般在卵固定后水洗染色，用琼脂与石蜡进行双重包埋，最后进行切片、脱腊和封固，进行观察。,7.23体外受精,体外受精,（,in vitro fertilization,，,IVF,）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。,主要包括：成熟或未成熟的,卵母细胞获得,、,体外培养系统的建立,、,处理附睾内和射出精子,、使,精卵结合,受精、受精卵的体内或体外培养（,in vitro culture,，,IVC,）、移植妊娠和产仔,由于体外受精在实验室进行，所以得到的动物或人称为,“试管动物”或“试管婴儿”,。,历史,1951年Chang和Austin发现了精子的获能现象，为体外受精的实现打开了通路。,1954年，Thibault等获得第一只体外受精的兔子。随着研究深入，试管老鼠、试管猪、试管牛等相继产生。,1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“试管婴儿”，至此，体外受精技术逐渐成熟。,过程,获得获能的精子和成熟的卵母细胞后，应在塑料平皿底部，用已经处理获能的精子浮游液,5l,精子浮游液，注入小滴中，将成熟培养后的卵母细胞，或自体内手术冲出的卵母细胞，以,BO,液冲洗，用微吸管吸,10,个卵母细胞与少量,BO,液注入精子浮游液小滴中。在,CO,2,培养箱中培养,7,小时后再经微量吸管自小滴中用,BO,液多次冲洗以洗去多余的精子。然后移入发育培养液（,TCM,199,10,FCS,）继续培养。,显微操作协助受精,在显微操作仪下进行显微受精，即对哺乳动物的精子和卵母细胞，进行显微操作，促使其相互结合技术，这可以解除透明带和质膜对精子的阻挡作用。,1976,年，,Uehara,和,Yanagimachi,将仓鼠或人的精子在显微操作仪下，通过显微工具，注射到仓鼠卵母细胞的细胞质中，使精子核在卵胞质中染色体解螺旋形成了原核。随后，又深入研究了操作技术，分成了卵胞质内精子注射、透明带下注射、透明带钻孔和透明带部分切口等几种。,卵母细胞质内注射,卵母细胞质内注射，是将整个精子或精子头部直接注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射吸管内径通常为,5,10m,，并尽量避免液体进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等，可省去获能和顶体反应。,还可以将,1,个或多个精子注入透明带下，可以一步直接将精子注射到卵周隙，也可以先将透明带钻孔或部分切口后，再进行精子注射。使用的精子应该是获能和发生顶体反应的。当然，当注射多个精子时可能发生多精受精现象。,其它一些方法,如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（,pH2.5,）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。,先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过,30,的妊娠或出生率，而且并没有增加孤雌活化率和多精受精率。,另外，可以用微细玻璃针或金属微刀片，在透明带上切开或挑开或撕开一个口再经适当浓度精子受精。,试管婴儿的诞生,按常规获取精液，经离心洗涤孵育使精子获能，应用,PVP,液限制精子活动。,人的卵母细胞经正常和超排取得，经,Ham F10,或,T6,培养,6,8,小时，用透明质酸酶除去卵丘细胞。,注射吸管外径为,2.5m,，固定吸管外径,15,20m,，内径为,4.5m,。在显微操作仪下，用注射吸管自尾部将精子吸入,1,6,个。用固定吸管吸住卵，使极体在液滴“,12”,点钟或“,6”,点钟的位置。注射吸管自“,3”,点钟位置刺入卵胞质内注入一或多个精子，其后轻微撤出注射吸管，将卵母细胞由固定吸管释放下去。,注射完后，经过培养卵裂后，即可以移植。,一般只要卵子正常，精子的核正常而外形异常的都可以通过体外受精诞生试管婴儿。,体外受精的意义,可以用来研究受精机理，,治疗人类男性和动物的生殖不育，,可以利用体外受精卵的发育状况或染色体核型检测用来检测形态不正常精子其染色体是否正常，,可以产生大量的转基因动物，,还可以简化烦杂的冻精技术，或许只保存核物质，就可以达到受精的目的，这对保护珍贵的动物资源，将起到重要的作用。,总之，体外受精技术已经广泛应用于发育生物学、医学、畜产学、实验动物学等各个领域。,7.3,胚胎操作,7.31,胚胎培养,7.32,胚胎移植,7.33,胚胎保存,7.34,胚胎分割,7.35,胚胎嵌合,胚胎收集,胚胎培养之前，先从动物子宫内将胚胎收集不同的动物其收集方法是不一样的。,以小鼠为例，一般用颈部脱臼法杀死小鼠，开腹取出子宫和输卵管并将其各部分离，分别放于,37,生理盐水或,M2,BSA,中，在实体显微镜下，用尖钟表镊子撕开输卵管，可以见到受精卵或卵裂胚胎，亦可以冲洗法将胚胎冲到平皿中。如冲洗囊胚，可用注射器针头自子宫角的输卵管端插入，推入,0.2,0.5ml M2,BSA,液，将胚胎冲到平皿中。,对于像牛等大型动物而言，如果要取受精卵或早期卵裂胚，应用手术方法冲洗输卵管或将牛杀死取出输卵管冲洗之。但,6,天后的胚胎，已经移行到子宫角前部，可以用非手术的方法取之。,7.31,胚胎培养,培养开始之前，对实验室和所用的培养器具进行彻底清洗、灭菌、清除可能的残存的细胞毒性物质。,培养液的组成，包括水、无机离子、有机成分、能源物质、,pH,值、渗透压等对胚胎发育均有很大影响。,现代培养液分为如,Whitten,氏液、,Brinster,液、,BMOC,3,和,CZB,液等简单培养液和,TCM,199,、,CMRL 1066,、,Ham,氏液和,DMEM,液等复杂培养液两类。,培养方法,即,微滴培养法、输卵管培养法和中间受体培养法,。,微滴培养法,是利用塑料平皿制成,50l,培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到,5,CO,2,、,95,空气饱和湿度的,37.5CO,2,培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。,输卵管培养法,取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。,中间受体培养法是指，操作后的胚胎可将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。,胚胎细胞计数法,即,空气干燥法,和,荧光染色法,。,空气干燥法,是将胚胎放入,1,柠檬酸钠溶液中低渗,10,20分钟，尽量少带液体，将胚胎吸到洁净载片上，再用固定液固定。空气干燥后，经,Giemsa,染色、计数。,荧光染色法,可以广泛应用于牛、羊、仓鼠、小鼠、兔子、猪等胚胎计数，常用的染料有,Hoechest 33342,，复染液为用,2.3,柠檬酸钠配制的,0.1,或,0.01,的台盼蓝（,TB,）液。,7.32,胚胎移植,胚胎移植（,embryo transfer,，,ET,）一般是针对早期胚胎而言，它是指附植前的早期胚胎很容易由子宫中取出，经过人为处理，可以再送入子宫的过程，这胚胎生物工程的基本技术。,同期发情,胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情（,oestrus ynchronization,），包括自然同期发情和人工同期发情。,自然同期发情,即不经任何药物处理，依靠动物自身的性周期规律，选择处于适当时期的母畜作为受体。,实际操作中，多用性激素进行,人工同期发情,。,以小鼠为例，将自然排卵或人工超排的小鼠与结扎输精管的公鼠交配，造成假孕。子宫移植时，一般选用假孕,2.5,天的母鼠。,胚胎的活力 的检测,形态学标准进行检测,：首先看胚胎的外形，要求形态正常，卵裂球均一，透明带完整。其次要鉴别采卵时间是否与胚胎发育时期相吻合。如果发育时间落后于采卵时间，则胚胎本身可能有问题。,也可以用,0.5,的,台盼蓝对胚胎做染色处理,，活细胞是不被着色。一般有一半以上卵裂球着色的胚胎发育能力较差。,胚胎移植,移植分为,手术移植,和,非手术移植,，在无菌条件下，向输卵管或子宫内用微吸管将吸入的胚胎注入，在小鼠、大鼠和仓鼠都应在动物背部开口，找出输卵管将胚胎移入,向子宫内移植多在囊胚期，成功率较高，在小鼠和大鼠，可达到,70,80,。,羊和猪一般是开腹进行手术移植，在牛，目前多进行非手术移植。,手术法移植,手术法是指将动物保定、全身麻醉或局部麻醉后，清理手术部位。,在背部或腹中线开口，将输卵管或子宫拉出体外。,如果进行输卵管移植，把吸好胚胎的移植管由输卵管伞口插入管内，尽量插得深一些。然后把胚胎吹入输卵管内。移植时，应尽量少带入液体。,如果进行子宫移植，在离子宫角与输卵管接合部约,5cm,处，先用钝头针扎一小孔，随即抽出，把移植管顺此孔插入子宫腔，吹入胚胎。复位、缝合。,手术法一般是移植卵裂早期的胚胎。,牛胚胎移植,用人工受精管，通过子宫颈进入子宫体，然后注入胚胎,7.33胚胎保存,保存的方法可以分为,非冷冻保存,和,冷冻保存,。,非冷冻保存是,1948,年，由,M.C.Chang,等开创的，他们将兔,2,细胞胚胎，在同种血清中,37,保存,48,小时，移植后产仔。,非冷冻保存主要有三种方法，即,异种动物体内保存法、卵和胚胎的,37,保存法和冷藏保存法,。,异种动物体内保存法,又称为,中间受体培养法,，是指把一种动物的胚胎，移入另一种动物的输卵管或子宫内，短期保存后再取出的方法，但并不是所有的动物都能在另一种动物的输卵管或子宫内存活的。,琼脂包埋移植法,是指将胚胎移植到,1,的琼脂液中，用口径适宜的微吸管把胚胎连同少量琼脂液一起吸入。当琼脂凝结后再将其压出，胚胎就被封入圆柱形琼脂小柱中，每个琼脂小柱放,3,5,枚胚胎，再把这个琼脂小柱封入较大的,1.2,琼脂圆柱内。然后，通过胚胎移植技术，将琼脂柱移入中间受体输卵管中。移植前，预先结扎输卵管与子宫的接合部。,直接移植法,是不经琼脂处理，直接移入预先结扎过的受体输卵管中。经过短期培养后，将胚胎从输卵管内冲出，观察发育情况。对发育良好者，移植入同期发情的同种动物受体内，使其产仔。,37保存法,是指在,37,下，短时间保存卵和胚胎。,由于是在胚胎培养的条件下进行，因而应当考虑到保存时间和胚胎发育、卵老化等问题。,例如，兔和小鼠的,4,6,细胞胚胎，经过,96,小时在,37,保存，已经发育到胚泡阶段。一般而言，经过,48,小时体外保存，再移向受体，胎儿的发育率要下降,50,，保存时间越长发育率越下降。,就卵母细胞而言，排卵或由卵泡取出后，受精能力有一定限度，所以保存时间长，即或能受精，也可能出现胚胎发育异常。,冷藏保存法,低于室温，但还达不到冷冻阶段的温度对胚胎进行保存即为冷藏保存法，一般在,0,10,左右保存。,由于低温，可以抑制物质代谢的速度和细胞分裂的速度，因之可以延长保存时间。,冷冻法,冷冻法是指196保存胚胎，在进行超低温冷冻前，必须进行冷冻保护剂处理。一般说来，在80以上时，细胞则逐渐失去活力，到130以下，细胞内的水分呈微细冰晶样或玻璃样结构，细胞内所有需要能量的反应停止，细胞的活动也几乎停止。,最早，小鼠中获得成功。,冷冻过程中细胞受到的损害,在冷冻过程中，细胞会受到两方面的损害。,快速冷冻时，细胞内形成的冰晶，对细胞膜和内部结构产生机械性损害，这是指冷冻的物理损伤。,当缓慢降温时，细胞内的水，有足够的时间完全渗到外面，从冰点缓慢降到细胞完全脱水，往往需要几个小时或更长时间，细胞一直处于高浓度溶质中。如不加抗冷冻剂，细胞也会受到损害，这是冷冻的化学损伤。,防止冷冻损伤,在冷冻液中，可以加入冷冻保护剂，如,DMSO,、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。,冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生，这种促使溶液结冰的方法称为,诱发结晶或植冰,（,seeding,）。一般，在,37,之间诱发结晶。,现在，人们已经使用玻璃化法冷冻胚胎获得成功，在冷冻保存液中加入高浓度的冷冻保护剂，使溶液粘性增强，当处于超低温时，形成玻璃样液体。,动物胚胎的一般保存程序,动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。然后，把封闭好的安瓿从0冰室，转移到5-6的恒冷室中，用预先在液氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至40或70，再直接投入液氮中保存。,超低温冷冻保存方法,慢速冷冻、慢速解冻法,是最早建立起来的哺乳动物胚胎冷冻方法。,以低于,1/,分钟的速度降低到,40,或,70,（小鼠）、,60120(,牛,),、,80,（卵母细胞），再投入液氮。解冻速度也不超过,25/,分钟。其优点是脱水完全，细胞内不易形成冰，但比较费时，冷冻保护剂对胚胎作用时间长。,快速冷冻、快速解冻法,是指把胚胎慢速降温到,3035,，投入液氮。解冻可以在室温或,37,水浴中进行。该方法能较好地克服胚胎脱水少细胞内冰晶形成之间的矛盾，获得较高的存活率。解冻后，用蔗糖洗脱。,超低温冷冻保存方法,一步冷冻法,省去了洗脱冷冻保护剂，其主要特点是冷冻细管里的冷冻液和稀释液是分开的。细管里装有培养液、含胚胎的冷冻液、稀释液。该法适用于冷冻胚胎运输使用。,快速冷冻法,将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。,玻璃化法,简单、快速而有效，不需要冷冻仪，主要依靠溶液的玻璃化特性，将卵母细胞或胚胎同玻璃化液处理，然后直接投入液氮，解冻时快速进行。,牛胚胎冷冻,家畜胚胎冷冻以牛胚胎最为成功，添加牛血清或牛血清白蛋白的杜氏PBS，一直被广泛用于胚胎保存的基础液,。采用慢速冷冻、快速冷冻、一步法冷冻、玻璃化法，均可成功。,甘油比DMSO更有利于牛胚胎冷冻。,牛胚胎冷冻已经广泛应用于商业性胚胎移植工作。,7.34胚胎分割,同卵双生,胚胎分割的原理,根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。,胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如,卵裂球分离培养法,、,致密化前各期胚胎分割法,、,桑椹胚,至,囊胚期胚胎分割法,等。,卵裂球分离培养,卵裂球分离培养是将桑椹胚以前的卵裂胚去掉透明带，分离每个卵裂球，将其包埋于琼脂中，将包有卵裂球的琼脂柱，移到中间受体小鼠或兔的输卵管中，经数日活体内培养后，再取出已经发育到多细胞的胚胎，移于受体子宫。,这种方法已经在牛、羊、马生出同卵多胎。,对研究卵裂球位置与分化方向以及研究嵌合胚、不同卵裂球遗传性等，都是一种很有用的技术。,致密化以前各期的胚胎分割,对于致密化以前各期的胚胎，由于卵裂球之间彼此尚未建立起紧密联系，分割时较容易进行。根据胚胎的直径，制作适宜口径的固定吸管和吸取卵裂球用的微吸管。在显微操作仪上，用固定吸管固定住胚胎，然后用微玻璃针自上而下切开透明带，使其成为一个切口。将微吸管自切口处伸入，吸住半数卵裂球，慢慢取出，这样即可以把胚胎一分为二。把吸出的半胚或卵裂球，纳入空透明带中。空透明带是将废弃的卵母细胞或不合适的胚胎，去除其内容物即可。然后将分割后的胚胎包入琼脂柱，通过中间受体培养。依照同样的方法，可以将胚胎分割成为四或八分胚。,桑椹期的胚胎分割,用微玻璃针或微刀进行分割，无需固定吸管，由于透明带韧性较强。,切割之前需要对其进行软化处理，处理标准是：48细胞胚胎用0.5酶液处理12分钟；桑椹胚用0.20.3酶液处理30秒钟；囊胚则用0.20.3酶液处理30秒以下。,过程,把经过软化处理的胚胎，与少量培养液一起置于载片上，把针或微刀的刃部调节到胚胎的正上方。然后自胚胎的等分线向下移动，把胚胎轻轻压住，继续下切，胚胎就被压扁，继而被切开。再把切割的胚胎纳入空透明带。,囊胚切割时，需将内细胞团一分为二，早期的囊胚的二分胚发育率，比桑椹胚的二分胚发育率要低，可能是因为囊胚正处于进一步的细胞分化状态，操作后胚胎的调整能力比桑椹胚差。相对而言，二分胚、四分胚比较容易培养，而八分胚的存活率很低。,过程,胚胎分割,7.35胚胎嵌合,嵌合体（,chimera,）,是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态,发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为,原发性嵌合体,，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为,次生性嵌合体,1901,年，,Spemann,最早开始进行动物嵌合体的研究，他进行了蛙嵌合个体的培育，其目的是为了研究两栖类动物的发育机制。,1960,年，,Mintz,开始研究嵌合体制作技术，到,1965,年第一次获得活至成体的正常小鼠嵌合体。,植入前胚胎嵌合体的制作方法,聚合法,第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（,pH2.5,）或,0.5,链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有,5g/ml,植物凝集素,A,（,PHA,）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和,PHA,的作用，更易聚合。若放到,37,时，效果更佳，聚合完毕后，洗除,PHA,，继续培养，或进行胚胎移植。,第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助,PHA,的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。,第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用,PHA,使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。,囊胚注射法,囊胚注射法是把某些种类细胞注射入囊胚的囊胚腔中，注射的细胞可以是卵裂球、内细胞团细胞、胚胎干细胞，甚至是已经分化的细胞。若注入的细胞并入内细胞团并参与胚体的形成，那么就形成了嵌合体。注射时，选取健康、生长良好的细胞。如果是培养细胞，应该保证其整二倍体性。将,10,12,个细胞吸入到注射吸管的顶端。用固定吸管吸住内细胞团与滋胚层交界处，让内细胞团位于囊胚的底部位置。调整注射吸管与固定吸管使处于同一焦点平面，选择滋胚层细胞间的“间隙处”，将注射吸管插入囊胚腔。将细胞推入囊胚腔，使之落到内细胞团之上。操作后的囊胚形态不规则，经短期培养后，可以恢复正常状态。,制作过程,小鼠嵌合体的制作过程,分析是否是嵌合体及嵌合的程度,两种：色素分析法和遗传分析法,色素分析法简单、直观，比较实用。一般选用肤色、毛色差异明显的动物的胚胎作为供体胚，如用白鼠或黑鼠。幼鼠生下45天后，就可以分析其肤色或毛色，怀孕10天左右的小鼠胎儿，眼睛就有色素沉积。或者在出生时，检查眼睑色素情况，确定是否是嵌合体。,使用同工酶分析,首先分析动物特定的同工酶谱系，然后选择具有不同图谱的两种或多种动物作为供体动物提供胚胎。,如果获得的动物是嵌合体，那么同工酶谱中应显现与供体动物相对应的特定谱带，不同品种动物的同工酶均有表现。,现在比较常用的是磷酸葡萄糖异构酶（,GPI,）分析，其原理是果糖,6,磷酸在,GPI,作用下，产生葡萄糖,6,磷酸，在,6,磷酸葡萄糖脱氢酶和,NADP,作用下，使,G,6,P,成为,6,磷酸葡萄糖酸盐，,NADP,还原为,NADPH,。经,GPI,染液染色，可显示出同工酶谱带。,分析时，从嵌合动物中取不同组织器官，匀浆后制成电泳样本，在醋酸纤维素板上点样，电泳、染色处理。与标准的同工酶谱对照，鉴定是否是嵌合体。,胚胎嵌合的意义,胚胎嵌合技术可以作为研究分析哺乳动物发生机制的重要手段，例如研究卵裂球分化潜力，研究性分化机制与性比，研究,X,染色体失活及其作用和研究胚胎细胞基因表达的机制；也可以对生理功能分析的应用，例如对免疫功能、遗传病的研究分析；还可以培育杂种个体，甚至是种间杂种；可以通过制作各种组合的嵌合体，培育新的毛皮动物；利用种间移植，分析胎儿和母体的相互关系。,参考书目,哺乳动物胚胎学,秦鹏春等,科学出版社,动物细胞工程 原理与实践,冯伯森等,科学出版社,哺乳动物的发育工程,谢厚祥等,湖南科学技术出版社,