基因工程步骤专业知识培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程步骤专业知识,*,基因工程步骤专业知识,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区下游,调控遗传信息的表达,(,调控序列,),外显子,(,能编码蛋白质,),内含子,(,不能编码蛋白质,),启动子,终止子,2,基因工程步骤专业知识,非编码区,非编码区,编码区,与,RNA,聚合酶结合位点,外显子,内含子,1,2,3,4,5,转 录,mRNA,前体,成熟,mRNA,加 工,切除内含子转录部分,3,基因工程步骤专业知识,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,能转录相应的信使,RNA,，能编码蛋白质,4,基因工程步骤专业知识,基因工程的基本操作程序,目的基因的,获取,基因表达载体的,构建,将目的基因,导入,受体细胞,目的基因的,检测与鉴定,5,基因工程步骤专业知识,一、目的基因的获取,用,3,分钟阅读,P8-11,，并思考下列问题，然后用,2,分钟与同桌交流、讨论。,1,、获取目的基因的常用方法有哪些,?,2,、何谓基因文库？其类型有哪几种？,3,、如何构建基因文库？,4,、何谓,PCR,技术？其原理、条件和过程是怎样的？,6,基因工程步骤专业知识,一、目的基因的获取,1,、目的基因：主要指的是编码蛋白质的,结构基因,，也可以是一些具有调控作用的因子。,2,、获取方法：,（,1,）从基因文库中获取目的基因；,（,2,）利用,PCR,技术扩增目的基因；,（,3,）通过,DNA,合成仪用化学方法直接合成,7,基因工程步骤专业知识,3,、基因文库,又称,DNA,文库，将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，所有受体菌的集合即为该生物的基因文库。,基因文库由,外源,DNA,片段、载体,和,宿主,组成。,按外源,DNA,片段的来源分基因文库分为：,基因组,DNA,文库：包含了某物种的所有的基因,部分基因文库：只包含了部分基因文库（如,cDNA,文库）,8,基因工程步骤专业知识,9,基因工程步骤专业知识,1,）载体,DNA,片段的制备,DNA,分离纯化限制酶切,2,）供体,DNA,片段的制备,总,DNA,分离纯化酶切法分离特定大小,DNA,片段,3,）载体与基因组,DNA,片段的连接,4,）重组,DNA,转化受体细胞,4.,基因文库的构建,10,基因工程步骤专业知识,基因组文库的构建,通过对受体菌的培养而储存基因,11,基因工程步骤专业知识,cDNA,文库的构建,（,反转录法）,目的基因的,mRNA,单链,DNA,反转录酶,DNA,聚合酶,双链,DNA(,目的基因,),接到载体,12,基因工程步骤专业知识,基因组文库和部分基因文库的比较,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,基因中启动子,基因中内含子,基因多少,物种间基因交流,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,13,基因工程步骤专业知识,思考：,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,根据基因的有关信息如,根据基因的转录产物,mRNA,、基因的核苷酸序列、基因翻译产物蛋白质,等来获取目的基因。,14,基因工程步骤专业知识,2,、利用,PCR,技术扩增目的基因,聚合酶链式反应,PCR,15,基因工程步骤专业知识,概念,：,PCR,全称为,_,，是一项在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_ _,、,_原理：,_,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,双链复制,已知基因的核苷酸序列,(,前提条件,),四种脱氧核苷酸,成对引物,DNA,聚合酶,(Taq,酶）,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,16,基因工程步骤专业知识,过程：,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火（,复性,55-65,）：系统温度降低，引物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，,合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,17,基因工程步骤专业知识,PCR,的基本反应步骤,变性,90-95C,延伸,70-75,C,退火,55-60C,PCR,总结：,18,基因工程步骤专业知识,3,、化学方法人工合成目的基因,基因比较小,已知核苷酸序列，直接利用,DNA,合成仪用化学方法合成，不需要模板。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,19,基因工程步骤专业知识,从基因文库中获取,利用,PCR,技术扩增,利用化学方法人工合成,归纳：获取目的基因的方法,20,基因工程步骤专业知识,质粒,DNA,分子,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,同一种 限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,1,、基因表达载体的构建方法,22,基因工程步骤专业知识,2.,基因表达载体的目的,（,1,）使目的基因在受体细胞中稳定存在并可以遗传给下一代,（,2,）使目的基因能够表达和发挥作用。,23,基因工程步骤专业知识,3,、基因表达载体的组成：,a,、目的基因,b,、,启动子,c,、终止子,d,、标记基因等,思考：它们有什么作用？,24,基因工程步骤专业知识,表达载体为什么一定要有启动子？,（,1,）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达。,（,2,）通过,cDNA,文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。,25,基因工程步骤专业知识,终止子的作用是什么？,终止子是位于基因尾端的一段特殊的,DNA,片断，能终止,mRNA,的转录。,是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来。,标记基因有什么作用？,26,基因工程步骤专业知识,1,、原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径,三、将目的基因导入受体细胞,2,、方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞27,基因工程步骤专业知识,（,1,）农杆菌转化法,特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,28,基因工程步骤专业知识,转化过程,:,Ti,质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色,DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,29,基因工程步骤专业知识,基因枪法又称微弹轰击法，是,利用压缩气体产生的动力,，将包裹在金属颗粒表面的表达载体,DNA,打入受体细胞中,，使目的基因与其整合并表达的方法。,（,2,）基因枪法,单子叶植物,适用此方法,30,基因工程步骤专业知识,（,3,）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加,DNA,（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于,被子植物,31,基因工程步骤专业知识,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,32,基因工程步骤专业知识,2,、将目的基因导入动物细胞,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,方法：显微注射法,33,基因工程步骤专业知识,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、,遗传物质相对少,过程：,Ca,2+,处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收,DNA,3.,将目的基因导入微生物细胞,34,基因工程步骤专业知识,四、目的基因的检测与鉴定,分子水平检测,:,是否插入目的基因,是否转录,是否翻译,个体生物学水平鉴定,35,基因工程步骤专业知识,1,、检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组,DNA,；,（,1,）方法,:,DNA,分子杂交,（,2,）过程,:,将含目的基因的,DNA,片段用放射性同位素等作标记,以此做探针；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体,DNA,中。,（一）检测,36,基因工程步骤专业知识,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,37,基因工程步骤专业知识,（二）鉴定（个体生物学水平）,2,、检测目的基因是否转录出了,mRNA,3,、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,:,分 子 杂 交,方法,:,抗原,-,抗体杂交,（蛋白质是抗原）,过程,:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,。,38,基因工程步骤专业知识,