生物强化处理.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主要内容,生物强化技术产生背景,生物强化技术的作用机理及特点,生物强化菌剂的来源,生物强化技术在水污染治理中应用的意义,生物强化技术工艺发展现状及应用效果评价,现代生物技术在生物强化研究中的应用,一、生物强化技术产生背景,两个基本概念,Bioaugmentation,：,生物强化，生物增强，投菌法,Bioremediation,：,生物修复，生物整治,产生背景,二十世纪七十年代中期,Superbugs rescue waste plant.(Anon,1977,Chemical Week),对采用生物强化技术存在的争议,普遍存在,适者生存,Bioremediation and Bioaugmentation,Bioremediation,will be defined as the use of selected microorganisms to accomplish a biological cleanup of a specified contaminated area,such as soil or water.,Bioaugmentation,will be defined as the application of selected microorganisms to,enhance,the microbial,populations,of an operating waste treatment facility to,improve,water quality or,lower,operating costs.,In other words,bioremediation deals with a,finite project or area,while bioaugmentation involves working to improve a,continuous process,.,二、生物强化技术的作用机理及特点,作用机理,直接作用,共代谢作用,基因水平转移作用应用特点,优点,操作简单，因地制宜，应用灵活,针对性强，见效快,缺点,系统中高效菌数量和活性不易控制,共代谢,就是对于一些有毒有害物质，微生物不能以其为碳源和能源生长。但在其它基质存在下能够改变这种有害物的化学结构使其降解。如以甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为主要基质生长的一些菌可以产生一种氧合酶，这种酶可以共代谢三氯乙烯(TCE)。,生物强化作用机理,三、生物强化菌剂的来源,从,自然界筛选,构建基因工程菌,直接购买商业菌剂,从自然界筛选高效菌种的步骤,选择环境,（水或土壤）,分离适应性菌株,选择特殊降解性菌株,选择高效菌株,接受突变剂进一步筛选,增强酶活性,增强胞外酶分泌,增强效应因子分子作用,降低阻碍分子作用,发酵培养单一菌株,摇瓶培养,发酵罐培养,菌剂,富集反应器（off-line enrich-reactor),富集反应器,典型活性污泥工艺,出水,剩余污泥,有毒有害废水,富集基质和诱导物,获得特定的目标基因,目标基因片断,载体（质粒或病毒）,质粒DNA片断,重组DNA,重组DNA进入受体细胞内扩增并表达,具目标基因表达功能的重组体,核酸内切酶切割,核酸内切酶切割,细胞外重组,转化（质粒）、转导或转染（病毒）,利用遗传标记筛选,基因工程菌构建过程,Gene cloning and Expression,using Plasmid pBR322,基因工程菌应用实例,Burkholderia cepacia,G4，在芳香族化合物存在的条件下能够共代谢三氯乙烯(TCE)，但降解中间产物会对该菌起毒害抑制作用。,通过Tn5插入产生,Burkholderia cepacia,G4 5223-PR1，能够从结构上表达降解TCE的邻甲苯单氧合酶，因此在没有诱导物（如芳香族化合物）的情况下也可降解TCE（Winkler et al.,1995）。,商业菌剂,形态,干化和液态,组成,自养、异养和兼性菌,选择注意事项,(1)在较低或较高温度下生长的能力;,(2)抵抗高浓度污染物的能力,(3)抗重金属的能力,(4)在较宽泛的环境和介质中生存的能,(5)产生生物表面活性剂，更利于与污染物接触。,四、生物强化技术在水污染治理中的应用现状,高浓度有机废水；,有毒、有害难降解污染物的治理,；,脱氮除磷；,改善系统污泥特性，降低污泥产量；,强化废水中油脂的液化和降解,江河湖泊等的水体修复,地下水生物修复,生物强化技术在水污染治理中的应用实例,Groundwater bioremediation,Ground water bioremediation,Plumber best friend,BioOne,A Daphnia speciesActual size-2mm.,Before bioaugmentation,After bioaugmentation,生物强化技术在水污染治理中的应用效果评价,提高对目标去除物的去除效果,改善污泥性能，减少污泥产生,加快系统启动，增强耐负荷冲击能力和系统稳定性,对目标去除物的去除效果提高,Selvaratnam 等人筛选到一株苯酚的高效降解菌，Pseudomonas putida ATCC 11172，将这种菌投加到SBR反应器中，这种菌在40天内对苯酚的降解率始终维持在95%-100%，而那些没有接种高效菌种的反应器，苯酚的去除率由初始100%降低到40%。,Chin在附着生长生物床加入降解BTX（苯、甲苯、二甲苯）的混合优势菌，在HRT为1.9小时时，生物增强系统可去除10mg/l 的BTX，而非强化系统去除仅为3.2mg/l改善污泥性能，减少污泥产生,生物增强作用不仅可以有效消除污泥膨胀，增强污泥沉降性能，而且大大减少了污泥的产生，一般可使污泥容积降低17%到30%。,Chamber研究生物增强技术在延时曝气、曝气塘和氧化沟三种不同系统中的应用。在延时曝气系统中，接种生物增强剂三周后就成功地消除了污泥膨胀，而在氧化沟中四周后污泥膨胀消除。,加快系统启动，增强耐负荷冲击能力和系统稳定性,Belia和Smith发现，向传统活性污泥中加入10%的降解磷的纯菌，那么整个系统成为一个高效脱磷系统（脱磷率达90%以上）只需14天，而只用活性污泥驯化达到此脱磷率需要58天时间。,Edgehill等人用降解五氯酚（PCP）的纯菌来增强活性污泥系统，当加入10%（相对于固有菌量）的纯菌，就会使PCP废水驯化期大大缩短。当PCP负荷由40 mgl,-1,升高到120mgl,-1,时，出水则达到60mgl,-1,，单纯的活性污泥系统恢复正常需48h，但加入5%或7%的纯菌（相对于固有菌量），系统在18h内就使PCP出水达到15mgl,-1,，表现出良好的抗负荷冲击的能力。,生物强化技术在水污染治理中应用失败及原因探索（一）,废水成分复杂，用生物增强技术本身难以达到治理目的和要求。,废水中微生物可利用其生长的底质的浓度太低，不足以维持其生长。,投入的菌不如系统中固有菌的竞争能力强，不能强有力地摄取有限的营养物质。,系统中原生动物等捕食性动物将优势菌捕食。,生物强化技术在水污染治理中应用失败及原因探索（二）,优势菌优先利用其他易于利用的底质，对目标降解物作用缓慢。,废水中存在抑制性基质，抑制菌的生长和代谢。,投入菌的量不足以使其在菌群中占优势，或由于控制不当菌体流失。,不利的环境因素如废水的pH、温度、DO的影响。,五、现代生物技术在生物强化研究中的应用,PCR,FISH,PCR-RFLP,PCR-DGGE,PCR-RISA,传统的微生物定量化及群落分析方法,活皿计数法（CFU),生境 可培养细胞百分比（）,海水 0.001-0.1,淡水 0.25,中营养型湖泊 0.1-1,活性污泥 1-15,沉积物 0.25土壤 0.3,最大可能数法（MPN),平板培养法缺点：,环境中可通过平板培养的微生物不超过百分之十几，污水和底泥中有些微生物群落不能够用培养的方法分析。,培养所需时间较长，不能够提供生物反应器实时、有意义信息。,难以获得微生物群落结构和空间分布的有关信息。,PCR(Polymerase chain reaction),基本步骤：,变性,:,采用高温使,DNA,变性，形成单链,DNA;,退火,:,降低温度，引物在与单链,DNA,互补的邻位结合，形成复合物,.,延伸,:,将温度调至,DNA,聚合酶的最适宜温度,该 以,dNTP,为原料，根据碱基互补的原则，按照模板,DNA,序列组成，从引物的,3端开始逐一将,dNTP,聚合上去，合成一条新的,DNA,双链。,PCR Amplifying DNA,PCR技术在环境检测中的应用主要有:,应用PCR技术研究某一特定环境中微生物区系的组成，进而了解其菌群动态。,应用PCR技术监测环境中特定种群（如致病菌、工程菌等）的动态。,应用PCR技术检测样品中的特定微生物种群，其基本步骤包括：,从环境样品中提取核酸（,DNA,或,RNA,）；,以提取的,DNA,或,RNA,样品为模板进行扩增；,对,PCR,反应产物进行检测与分析。,荧光原位杂交技术（,fluorescense in situ hybridization,FISH,）,FISH是目前单个细胞水平上分析微生物群落结构的常用的分子生态学方法，是用标记过的DNA寡聚物去探测未损伤的微生物群落。,原理,微生物细胞在载玻片上脱水后，与带有荧光染料标记的寡核糖探针在一定温度下混合。具有与探针碱基对完全互补序列的RNA随即与探针发生杂交，从而使该菌体在荧光显微镜下发出荧光。,细胞在测定过程中不被破坏，形状不改变，能够真实反映在自然微环境下的情况及分布特异性强能定量化操作简单迅速。,特点,将染色体、细胞或组织固定；,标记探针；,将探针与固定材料上的靶序列（,DNA,或,RNA,）,进行杂交；,检测杂交的结果,。,FISH基本步骤：,适用于所用菌种的,EUB338;,Alf968,适用于,Proteobacteria,的,亚纲,;,BET42,适用于,Proteobacteria,的,亚纲,;,GAM42,适用于,Proteobacteria,的,亚纲,;,CF319a,适用于,Cytophaga-Flavobacterium,;,ACA,适用于,Acinetobacter,;,Nso,190,适用于,Proteobacteria,的,亚纲的氨氧化菌,;,NEU23a,适用于,Nitrosomonas,属的耐盐及嗜盐菌,;,NIT3,可用于,Nitrobacter,;,S-S-Mae-1414-a-A-18,适用于,M.,erodenitrificans,。,一些常用的分子探针,微生物群落解析,应用1,用FISH法解析UASB颗粒污泥的微生物群落结构。,图中同时采用了两个探针进行FISH检测。探针EUB338能与绝大多数细菌杂交，发出绿色荧光；探针ARC915能与古细菌杂交，发出红色荧光。（A）低放大倍数；（B）高放大倍数。,污泥膨胀中丝状菌的鉴别，比例和分布,用FISH法检测某污水处理厂活性污泥中的丝状菌。,(A）相差显微镜下的污泥絮体；（B）同一显微镜视野下同时用探针G2M（绿色）和G123（红色）进行FISH法检测。黄色表示同时与两个探针结合，为丝状菌Eikelboom type 021N II，红色则为丝状菌,Thiothrix,。,应用2,污泥中聚磷菌的鉴别,应用3,用FISH法和DAPI染色同时检测活性污泥中的聚磷菌。,图中，蓝色作为DAPI染色的结果，代表在细胞体内聚集了大量聚合磷的细菌；而红色是FISH法的结果，代表与标记荧光染料的探针MP2发生杂交的菌体细胞，即,M.phosphovorus,。粉色是红色和蓝色的混合色，代表那些在细胞体内聚集了大量聚合磷的,M.Phosphovorus,细菌,。,生物标记技术(Biomarker),原理:,生物标记，或标记基因，是一段 DNA序列，将其引入微生物体内，使其具备一定的基因型或表现型，并能够在环境中检测出来.,PCR-RFLP技术,RFLP(restriction fragment length polymorhpisms),即限制性片断长度多态性，是研究生物进化和分化的有力工具，它依据的是一个生物体的基因组的独特特征和能被某些限制性酶识别的特殊碱基序列和特有的分布方式，对生物种类的鉴别具有高度的专一性，可作为一种高灵敏度检测污染环境下微生物种群变化的方法。,PCR-DGGE技术,DGGE(density-gradient gel electrophoresis),密度梯度凝胶电泳是将聚丙烯酰胺灌进具有垂直浓度梯度的变性剂（甲酰胺或尿素）中。当双链DNA片断电泳时，DNA在某一特定的变性浓度发生部分溶解，从而影响其迁移速度。选择适当的DGGE条件，DNA片断即使只有单个碱基的变化，也可以被分辩出来。,PCR-RISA技术,RISA(Ribosomal intergenic spacer analysis),16S和23S rRNA之间的片断即为RIS,对于不同的菌种，RIS的长度和DNA的序列有所不同，通过PCR扩增RIS，菌群的RIS电泳谱图可以显示出该菌群的结构特征。,RISA图,