生物化学第3篇-第10章-基因信息的传递--DNA的生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,复制(,replication),是指遗传物质的传代，以母链,DNA,为模板合成子链,DNA,的过程。,复制,亲代DNA,子代DNA,复制的基本规律,Basic Rules of DNA Replication,第一节,复制的方式,半保留复制,(,semi-conservative replication),复制的高保真性,(,high fidelity),双向复制,(,bidirectional replication),半不连续复制,(,semi-discontinuous replication),子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,密度梯度实验,实验结果支持,半保留复制,的设想。,含重氮-DNA的细菌,培养于普通培养液,第一代,继续培养于普通培养液,第二代,梯度离心结果,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DN,A的,碱基序列一致,，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的,保守性,。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但,不是绝对的,。,原核生物复制时，DNA从,起始点(origin),向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,二、双向复制,复制中的放射自显影图象,A.环状双链DNA及复制起始点,B复制中的两个复制叉,C.复制接近终止点(termination,ter),ori,ter,A B C,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子(replicon),。复制子是独立完成复制的功能单位。,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,三、复制的半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为,领头链,。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为,随从链,。复制中的不连续片段称为,岡崎片段,(,okazaki,fragment),。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的,半不连续性,。,DNA,复制的酶学,The Enzymology of DNA Replication,第二节,参与,DNA,复制的物质,底物,(,substrate):,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,聚合酶,(polymerase):,依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol,模板,(template):,解开成单链的DNA母链,引物,(primer):,提供3,-OH末端使dNTP可以依次聚合,其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP),n,+,dNTP (dNMP),n+1,+,PPi,目录,聚合反应的特点,DNA 新链生成需,引物,和,模板,；,新链的延长只可沿,5,3,方向进行。,二、,DNA,聚合酶,全称：,依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,活性：,1,.5,3,的聚合活性,2.核酸外切酶活性,目 录,5 A G C T T C A G G A T,A,3,|,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,?,能切除突变的 DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,（一）原核生物的,DNA,聚合酶,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,（一）原核生物的,DNA,聚合酶,功能,：,对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol ,（109kD）,323个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N 端,C 端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA，,进行分子生物学研究中常用的工具酶。,DNA-pol,（120kD）,DNA-,pol,II基因发生突变，细菌依然能存活。,它参与,DNA,损伤的应急状态修复。,功能,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol ,(250kD),（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在,线粒体DNA,复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,（二）真核生物的DNA聚合酶,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。,复制保真性的酶学机制：,（一）,DNA-,pol,的核酸外切酶活性和及时校读,（二）复制的保真性和碱基选择,（一）DNA-pol,的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。,B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,（二）复制的保真性和碱基选择,DNA,聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。,嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于,反式构型,。,1.遵守严格的碱基配对规律；,2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；,3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,四、复制中的分子解链及,DNA,分子拓扑学变化,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E.Coli,基因图,目录,解螺旋酶,(,helicase,),利用,ATP,供能，作用于氢键，使,DNA,双链解开成为两条单链,引物酶,(,primase,),复制起始时催化生成,RNA,引物的酶,单链,DNA,结合蛋白,(,single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,10,8,局部解链后,（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目录,拓扑异构酶作用特点,既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶,拓扑异构酶,分 类,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断DNA分子,两股,链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。,利用,ATP,供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目录,五、,DNA,连接酶,连接DNA链3,-OH末端和相邻DNA链5,-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA,连接酶,(,DNA,ligase,),作用方式HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目录,DNA,连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,第三节,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1,.DNA解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供3,-OH末端。,一、原核生物的,DNA,生物合成,E.coli复制起始点 oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1,.DNA解链,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2,.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,3,HO,5,引物酶,（二）复制的延长,复制的延长指在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,领头链的合成,目录,随从链的合成,目录,目录,阶段一,阶段二,阶段三,阶段四,复制过程简图,目录,复 制 过 程 动 画,原核生物基因是环状,DNA，,双向复制的复制片段在复制的终止点,(,ter,),处汇合。,ori,ter,E.coli,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）复制的终止,5,5,5,RNA酶,OH,P,5,DNA-pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA连接酶,随从链上不连续性片段的连接,目录,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G,1,G,2,S,M,二、真核生物的,DNA,生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。,蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。,复制有时序性,，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。,复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,染色体,DNA,呈线状，复制在末端停止。,复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。,染色体两端,DNA,子链上最后复制的,RNA,引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目录,目录,切除引物的两种机制,目录,端粒,(,telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子末端的结构。,功能,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质构成末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短 序列。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,端粒酶,(,telomerase),端粒酶,RNA(human telomerase RNA,hTR,),端粒酶协同蛋白,(,human telomerase associated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(,human telomerase reverse transcriptase,hTRT,),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目录,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways,第四节,逆转录酶,(reverse transcriptase),逆转录,(reverse transcription),RNA,DNA,逆转录酶,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,RNA 模板,逆转录酶,DNA,-RNA,杂化双链,RNA酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了,20,世纪初已注意到的病毒致癌理论。,滚环复制,(,rolling circle replication),三、滚环复制和,D,环复制,是某些低等生物的复制形式，如,X,174和M13噬菌体等。,3,-OH,5,-P,5,5,5,3,3,3,3,5,滚环复制,5,5,3,3,5,目录,dNTP,DNA-pol,D,环复制,(,D-loop replication),是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage(Mutation)and Repair,第五节,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为,突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为,DNA损伤(DNA damage),。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础,（二）突变导致基因型改变,（三）突变导致死亡,（四）突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,物理因素,紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射UV,化学因素,目录,三、突变的分子改变类型,错配,(,mismatch),缺失,(,deletion),插入,(,insertion),重排,(,rearrangement),框移,(frame-shift),DNA分子上的碱基错配称,点突变(point mutation),。,发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,1,.转换,发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。,2.颠换,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人Hb(HbA),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,A,G,基因,（二）缺失,、,插入,和框移,缺失：,一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：,原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变,是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目录,四、,DNA,损伤的修复,修复(repairing,),是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复,(,light repairing),切除修复,(,excision repairing),重组修复,(,recombination repairing),SOS,修复,修复的主要类型,（一）光修复,光修复酶,(photolyase),UV,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA聚合酶,OH,P,（二）切除修复,是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由,DNA-pol,和连接酶完成。,DNA连接酶,ATP,E.coli的切除修复机制,目录,切 除 修 复 动 画,（三）重组修复,（四）,SOS,修复,当,DNA,损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。,在,E.coli，,各种与修复有关的基因，组成一个称为,调节子,(,regulon,),的网络式调控系统。,这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过,SOS,修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而,DNA,保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。,附 录,催化DNA聚合,参与DNA损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,-,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,E.Coli,中的,DNA,聚合酶,