12基因工程的操作程序.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,复习回顾,1、基因工程又称为？基因工程的原理是?,2、基因工程中用到的工具中，“分子手术刀”是？来源是？其作用是？体现了酶的什么特性？作用部位是什么键？,3、限制酶切割之后的结果是产生？从中轴线两侧切割得到的是什么末端？从中轴线处切开呢？,4、获得目的基因需要切几个切口？产生几个黏性末端？切割质粒呢？,5、“分子缝合针”是？根据什么分为两大类？哪两大类？这两类酶的区别是？,6、DNA连接酶连接的是？DNA聚合酶连接的是？,7、DNA连接酶作用于什么键？,8、载体主要有哪几类？其中，最常用的是？它的本质是？,9、载体必须具备的四个条件是？,10、写出限制酶切割后的黏性末端。,基因工程的基本操作程序,原核细胞的基因结构,(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与,RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上,游有启动子，下游有终止子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA聚合酶,结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：,有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,问题1,一：,目的基因的获取,如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,1.,目的基因主要是指_,编码蛋白质的基因,目的基因指的是：,？,也可以是具有调控作用的因子,获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,目的基因,2、利用PCR技术扩增,目的基因,3、人工合成,目的基因,反转录法,化学合成法,(一)从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物,不同基因,的许多,DNA,片断，,导入,到,受体菌的群体,中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,1.基因文库概念,2.基因文库类型,基因组文库,部分基因文库,（,包含一种生物的,所有,基因,）,（包含一种生物的,一部分,基因）,(一)从基因文库中获取目的基因,3.基因组文库的构建,提取某种生物的全部DNA,用适当的 限制酶,一定大小的DNA片段,将DNA片段 与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,4.cDNA文库的构建,提取某种生物的某器官或,特定,发育时期的,mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体 连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA 聚合酶,导入受体菌 中储存,两种基因文库的主要区别如下表（课本P10）,文库类型,cDNA,文库,基因组文库,文库大小,小,大,基因中启动子,无,有,基因中内含子,无,有,基因多少,部分基因,全部基因,物种间的基因交流,可以,部分基因可以,总结,1、概念：PCR全称为_，是一项在生,物_复制_的核酸合成技术,3、条件：,2、原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA双链,复制,(二)利用,PCR,技术,扩增目的基因,模板,（目的基因）,原料,(脱氧核苷酸),引物,（一小段单链DNA）,耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）,温度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、结果：,5、扩增形式：,指数形式（2,n,）,在短时间内大量扩增目的基因,7、过程：,a、变性,（90-95）：双链DNA模板在热作,用下，_断裂，形成_,b、复性,（55-60）：系统温度降低，引物与,DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸,（70-75）：在Taq酶的作用下，从,引物开始进行碱基互补配对，合成与,模板互补的_。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,(二)利用PCR技术扩增目的基因动画演示,（三）人工合成目的基因,反转录法：,以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,化学合成法,DNA合成仪,推测,推测,合成,前提,：,基因比较小、核苷酸序列已知,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的,基因,问题4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,获取目的基因的三种方法应用,1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比较大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比较小，可采用_,PCR技术扩增,化学合成法,从基因文库获取的方法,复习回顾,1、基因工程的基本操作程序的四个步骤是？核心是？,2、目的基因指的是什么基因？,3、获取目的基因常用的三种方法是？其中人工合成法又包括哪两种?,4、基因文库包括哪两类？,5、PCR的原理是？PCR全称是？PCR扩增过程中的解旋方式是？PCR需要的条件有？,6、基因表达载体的构建的目的是？,7、一个基因表达载体的组成包括哪几部分？,8、标记基因的作用是？,9、启动子，终止子的位置，作用？起始密码子，终止密码子呢？,二：基因表达载体的构建基因工程的,核心,1,目的：,使目的基因在受体细胞中,稳定存在,，并且可以,遗传给下一代,，同时使目的基因能够,表达和发挥,作用。,2,组成：,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,等,启动子：,位于基因的,首端,的一段特殊的DNA片断，,RNA聚合酶,识别和结合的部位，启动转录,终止子：,位于基因的,尾端,的一段特殊的DNA片断，能,终止,mRNA的转录（与终止密码子区别）,标记基因：,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞,筛选,出来,3.基因表达载体的构建过程,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口,四个黏性末端,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口,两个黏性末端,三、将目的基因导入受体细胞,1,转化概念：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞,内维持稳定和表达的过程。,2,转化的实质：,目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上,生物种类,植物细胞,动物细胞,微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca,2,处理法,受体细胞,一般是体细胞,受精卵,-,4,、目的基因导入受体细胞的方法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞,染色体的,DNA上,。,三、目的基因导入受体细胞,构建基因表达载体,转入,农杆菌,植物细胞,导入,稳定维持和表达,过程：,（2）,基因枪法,：,目的基因导入,单子叶植物,细胞,基因枪法,（3）,花粉管通道法,：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,特点:十分简便经济。,例：转基因抗虫棉（我国）,（4）、将目的基因导入动物细胞,方法：,显微注射法,目的基因表达载体,提纯,取卵,（受精卵）,显微注射,受精卵 新性状动物,为什么动物细胞要用受精卵做受体细胞？,全能性受限制,（5）、将目的基因导入微生物细胞,微生物作受体细胞优点：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,常用菌：大肠杆菌,常用法：,Ca,2+,处理获得感受态细胞,（改变细胞壁的通透性）,过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态,细胞,感受态细胞,吸收,DNA,表达载体,与感受态,细胞混合,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少，且有的会摄入载体-载体，目的基因-目的基因类型,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,问题4,问题5,检查是否成功,分子,水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子杂交、DNA探针,分子杂交、DNA探针,抗原-抗体杂交、抗体,四、目的基因的检测与鉴定,方法：,接种实验,转基因生,物的DNA,探针,15,N,15,N,14,N,14,N,（,1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了,目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子杂交技术,变性,变性,知识延伸,DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,变性,方法,分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15,N,15,N,转基因生物,的mRNA,14,N,14,N,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法抗原-抗体杂交,苏云金杆菌,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,（4）除上述分子检测外，有时还需进行,个体生物学水平的鉴定：如抗性特性,检查是否成功,分子,水平,个体水平：,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子杂交、DNA探针,分子杂交、DNA探针,抗原-抗体杂交、抗体,四、目的基因的检测与鉴定,方法：,接种实验,归纳,:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,【资料】cDNA合成过程是：,第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA,互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。,第二步，核酸酶使RNA-DNA杂交分子中的RNA链,降解，使之变成单链的DNA。,第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用 下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,演讲完毕，谢谢观看！,