第5章-生产菌种的制备与保藏.ppt

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种子扩大培养的概念,发酵工业生产过程中的种子必须满足的条件,1)菌体的纯种培养物总量,适宜,，以保证在发酵罐中有适当的接种量；,2）微生物菌种的,生命力旺盛,，移接到发酵罐中后能够迅速生长，利于缩短延滞期，提高设备的利用率；,3）菌种能保持,稳定的生产性能，生理状态稳定；,4）无杂菌和噬菌体的污染。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.2 菌种扩大培养的任务,其任务：要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。,对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定,种子扩大培养的级数,。抗生素类产品的生产采用,放线菌,，一般采用,三级或四级,种子扩大培养；谷氨酸等氨基酸产品，以及部分酶制剂类产品生产，采用,细菌,，采用,二级种子,扩大培养。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.3 种子制备的过程(P118),砂土管孢子,冷冻干燥孢子,斜面培养,摇瓶液体培养,茄子瓶斜面培养,固体培养基培养,实验室种子培养阶段,二级种子罐培养,一级种子罐培养,生产车间种子制备阶段,（四级种子罐培养）,发酵罐,（三级种子罐培养）,种子扩大培养的工艺流程,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.3 种子制备的过程,一、实验室种子的制备,1）孢子的制备,细胞孢子,的制备：细胞的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为,37，时间为1-2 d，产芽胞的则需5-10 d。,霉菌孢子,的制备：一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然产品为培养基，培养温度一般为,25-28，时间为4-14 d。,放线菌孢子,的制备：一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，培养温度一般为,28，时间为5-14 d。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.3 种子制备的过程,一、实验室种子的制备,2）液体种子的制备,好氧培养,：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种,试管 三角烧瓶 摇床 种子罐。,厌氧培养,：对于酵母菌,(啤酒、葡萄酒、清酒等）,试管 三角烧瓶 卡式罐 种子罐。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,例：啤酒酵母,(P120),4保存于麦芽琼脂或MYPG培养基菌种,10 mL麦芽汁的500-1000 mL三角瓶,250-500 mL麦芽汁的500-1000 mL三角瓶,5-10 L麦芽汁的卡式罐,25，2-3 d,25，2 d，定时摇动或通气,15-20，3-5 d,211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,100 L麦芽汁的发酵罐,2025/10/31 周五,1.3 种子制备的过程,二、生产车间种子制备,1）种子罐的作用,便孢子发芽，生长繁殖成菌丝体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。,2）种子罐级数的确定,种子罐级数,是指制备种子需逐级扩大培养的次数，主要取决于两方面：菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；所采用发酵罐的容积。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.3 种子制备的过程,2）种子罐级数的确定,细菌,生长快，种子用量比例少，级数也较少，如,谷氨酸等氨基酸类产品以及部分酶制剂类产品,可用,2 级发酵，即：茄子瓶 种子罐 发酵罐。,霉菌,生长较慢，如青霉菌，可用,3 级发酵，即：孢子悬浮液 1 级种子罐（27 ，40 h 孢子发芽，产生菌丝）2 级种子罐（27 ，10 24 h，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体发酵罐。,放线菌,的细胞生长繁殖缓慢，如,抗生素类产品,，一般采用,3 级或 4 级种子扩大培养。,酵母,生长比细菌慢，比霉菌和放线菌快，通常用,3 级种子。如,啤酒酵母,的扩大培养，扩大倍数一般第,1 级到第 2 级为 8 10 倍，第 2 级到第 3 级为 4 6 倍。,第一节 生产菌种的制备过程,二、生产车间种子制备,2025/10/31 周五,二、生产车间种子制备,3）确定种子罐级数需注意的问题,A：种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。,B：种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌的机会。,C：虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选出用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,1.4 发酵工业种子培养方法,1）种子扩大培养的方法,：表面培养法、固体培养法（曲法培养）、,液体深层培养法,、载体培养法。,2）深层培养法的基本操作控制点,：灭菌、温度控制、通气与搅拌。,3）常用的液体深层培养法,：放大法、两步法、控制培养法、分批培养法（间歇发酵法）、连续培养法（连续发酵法）、补料分批培养法（流加法）。,第一节 生产菌种的制备过程,2025/10/31 周五,第五章,生产菌种的制备与保藏,211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,第一节 生产菌种的制备过程,第二节 生产菌种的质量保证,第三节 生产菌种的保藏,2025/10/31 周五,1、种子质量的判定,（,1）pH,；,（,2）培养基灭菌后糖、氨基酸、磷等的含量；,（3）显微镜下观察菌丝形态、菌丝浓度和培养液的外观色泽和颗粒等；,（4）其他参数，主要酶活力、产品含量等。,第二节 生产菌种的质量保证,2025/10/31 周五,2、影响种子质量的因素(P121),211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,（,1）培养基,（,2）培养温度和湿度,（3）培养时间(种龄),（4）接种量,（,5）通气和搅拌,（6）泡沫,（7）染菌的控制,（8）种子罐级数,第二节 生产菌种的质量保证,2025/10/31 周五,种龄,/h,种龄与碱性蛋白酶活力之间的关系,酶活力,/（U/mL）,接种量,/%,酶活力,/（U/mL）,接种量对碱性蛋白酶产生的影响,8 12 16 20,1 3 6 7 9,1000,800,600,400,1400,1200,1000,800,2025/10/31 周五,3、种子异常的分析,（,1）菌种生长发育缓慢或过快,（,2）菌丝结团,（3）菌丝粘壁,211.84.144.22/jing/C76/zcr-1.htm,第二节 生产菌种的质量保证,2025/10/31 周五,4、种子质量的控制措施,（,1）菌种稳定性的检查,方法：将保藏菌株溶于无菌的生埋盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。这一分离方法适用于所有的保藏菌种，并且一年左右必须做一次。,（,2）无杂菌检查,在种子制备过程中，每移种一次都需要进行杂菌检查。方法：显微镜观察，或平板培养试验，即将种子液涂在平板培养皿上划线培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。此外，也可对种子液的生化特性进行分析，如取样测其营养消耗速度、,pH 变化、溶氧利用情况、色泽、气味是否异常等。,2025/10/31 周五,5、种子质量标准,（,1）细胞或菌体,（菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观）,单细胞,：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态。,霉菌、放线菌,：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,（,2）生化指标,：种子液的糖、氮、磷的含量和,pH变化,（,3）产物生成量,：在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。,（,4）酶活力,：种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定关系。,2025/10/31 周五,第五章,生产菌种的制备与保藏,第一节 生产菌种的制备过程,第二节 生产菌种的质量保证,第三节 生产菌种的保藏,2025/10/31 周五,第三节 菌种保藏的原理和方法,2025/10/31 周五,提纲,菌种保藏的目的和意义,菌种保藏的原理和方法,斜面保藏法和穿刺保藏法,沙土管干燥保藏法,真空冷冻干燥保藏法,液氮保藏法,菌种复壮,种子扩大培养,2025/10/31 周五,菌种保藏的目的和意义,目的意义,：保持优良菌种优良性状的稳,定，满足生产的实际需要。,优良菌种丢失（退化）的原因：,世代短、易变异、易污染、死亡。,菌种保藏机构,：,世界现有,700多家专门机构。,措施,：创造条件，使微生物处于休眠状,态，减少变异。,低营养、低温、干燥、缺氧低代谢、低生长,2025/10/31 周五,菌种保藏的原理和方法,菌种保藏,(Culture conservation)原理,挑选优良的菌种，最好是休眠体,创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）,菌种保藏方法,斜面,(Slant)低温保藏法传代培养，六个月,砂土管保藏法适用范围广，两年,冷冻干燥(Freez-drying)保藏法长达十年,液氮超低温保藏法（-130,）,(Liquid nitrogen ultra-low temperature storage),2025/10/31 周五,一、斜面保藏法和穿刺保藏法,1.,斜面保藏法,：（短期，,3-6个月）,范围,：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌,方法,：适宜培养基适温培养冰箱,保藏,（,4-5）,到期转种,优点,：设备、方法简单,缺点,：转代多，易变异；污染机会多,2025/10/31 周五,一、斜面保藏法和穿刺保藏法,2.,穿刺保藏法,：（好气菌，,6-12个月）,方法：,小试管或螺口管,1琼脂培养基,接种,针穿刺,培养,盖,2-3mm无菌液体石蜡,冰箱保藏,范围：,细菌、放线菌、丝状真菌,优点：范围较广，简便实用,缺点：,不适用能利用石蜡为碳源的微生物；不同种类，,保藏期差异较大。,2025/10/31 周五,二、沙土管干燥保藏法,范围,：,产孢子的放线菌和,丝状真菌，形成芽孢,的细菌。,方法,：,沙、土分别洗净,烘干、过筛（,80-100目）,1-2 1沙土混合、装管1cm,121灭菌2-3 次,无,菌检验,烘干备用,孢子或悬液与沙土混匀,真空抽,干,封口（熔封、石蜡封）,干燥器中于冰箱,5保藏,特点,：,设备简单，方法较繁，效果较好（长，,2,年，有长达10年），但范围受限制。,2025/10/31 周五,三、真空冷冻干燥保藏法,方法,：,1.,安瓶管处理,：,8-10100-150mm，浸洗、烘干、,盖口；灭菌、干燥（60）。,2.,保护剂,：,减少冷冻干燥对微生物的损伤，常用脱脂,牛奶、血清（适当方法灭菌）。,3.,菌悬液制备,：,斜面加保护剂 制悬液吸入安管,4.,冷冻干燥,：,快冷至,-15-30，抽真空，15 分钟内达到66661Pa；升到13.3322Pa，升温至20-30；真空封口。,5.,安瓶管保藏,：,4-5 ，5-10年。（样品含水量1-3,）,2025/10/31 周五,四、液氮保藏法,方法,：,浓菌悬液,加保护剂,装安管,0.2-1cm,封口,降温（1/min）至-25，入液氮罐，-150,-196 保藏。,取出时，应于温水（38-40 ）中震荡1-2min。,特点,：,效果好（,2-3年，长达9年），方法简单，,保藏对象广泛。,2025/10/31 周五,五、菌种复壮,1、纯种的分离,2、淘汰衰退的个体,3、选择合适的培养个体,2025/10/31 周五,六、国内外主要菌种保存机构介绍,ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心,ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所,SH 上海市农业科学院食用菌研究所,CACC 抗菌素菌种保藏管理中心,IA 中国医学科学院抗菌素研究所,SIA 四川抗菌素工业研究所,CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心,AS 中国科学院微生物研究所,AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所,CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心,-,国内菌种保藏机构名称与缩写,2025/10/31 周五,国 外,ATCC(American Type Culture Collection）美国典型菌种保藏中心,ATCC 主要从事农业、遗传学、应用微生物、免疫学、细胞生物学、工业微生物学、菌种保藏方法、医学微生物学、分子生物学、植物病理学、普通微生物学、分类学、食品科学等的研究。该中心保藏有藻类111株，细菌和抗生素16865株，细胞和杂合细胞4300株，丝状真菌和酵母46000株，植物组织79株，种子600株，原生动物1800株，动物病毒、衣原体和病原体2189株，植物病毒1563种。另外，该中心还提供菌种的分离、鉴定及保藏服务。该中心保藏的菌种可出售。,NBRC(NITE Biological Resource Center)日本技术评价研究所生物资源中心 NBRC（IFO）是由日本经济部、商业部、工业部支持的半政府性质菌种保藏中心,。主要从事农业、应用微生物、菌种保藏方法、环境保护、工业微生物、普通微生物、分子生物学等的研究。该中心保藏有细菌,1446株，真菌568株，酵母164株。这些菌种主要来自本国的其它菌种保藏中心。该中心保藏的菌种可出售。,NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection)美国农业研究菌种保藏中心,2025/10/31 周五,本节课小结,种子扩大培养的概念,菌种扩大培养的任务,种子制备的过程,发酵工业种子培养方法,种子质量的控制,实验室种子培养,生产车间种子培养,影响种子质量的影响,种子异常表现,种子质量标准,种子质量的控制措施,2025/10/31 周五,本节课学习了,发酵工业种子的制备及种子质量的控制和菌种的保存,，下节课将讲授,发酵过程中的供氧,。,下节课讲授内容,2025/10/31 周五,1什么是种子的扩大培养？种子扩大培养的任务是什么？,2简述种子扩大培养的目的和意义。,3发酵工业对种子的要求有哪些？,4在菌种的扩大培养中，应注意哪些事项？,5简述种子制备的方式及其过程。,6影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子质量？,7.菌种保存的目的和原理是什么？主要有那些保存方法？,本节课思考题,2025/10/31 周五,继续学习的参考书及网站,1 李玉英.发酵工程 M.北京:中国农业大学出版社,2009.,2 李艳.发酵工程原理及技术 M.北京:科学出版社,20083 罗大珍,林稚兰.现代微生物发酵及技术教程 M.北京:北京大学出版社,2006.,4 刘振宇.发酵工程技术与实践 M.上海:华东理工大学出版社,2007.,5 陈洪章.生物过程工程与设备 M.北京:化学工业出版社，2003.,6 周五,May you success!,第三节 生产菌种的扩大培养,种子扩大培养,：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于,休眠状态,的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定,数量,和,质量,的纯种过程。这些纯种培养物称为,种子,。,作为种子的准则,菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；,生理性状稳定；,菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；,无杂菌污染；,保持稳定的生产能力。,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,3.1 种子的制备过程,种子制备的过程大致可分为：,实验室种子制备阶段,生产车间种子制备阶段,一、实验室种子的制备,实验室种子的制备一般采用两种方式,对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以,采用固体培养基或斜面（静置培养）培养孢子,，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。,对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用,液体培养法,(通过摇瓶培养提供比较好的溶氧）。,（一）孢子的制备,1、细菌孢子的制备,细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。,培养温度一般为,37,C。,细菌菌体培养时间一般为,12,天，产芽孢的细菌培养则需要,510,天。,2、霉菌孢子的制备,霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。,培养的温度一般为,2528,C。,培养时间一般为,414,天。,3、放线菌孢子的制备,放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。,培养温度一般为,28,C。,培养时间为,514,天。,（二）液体种子制备,1、好氧培养：,对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S.griseus）产卡那霉素的卡那链霉菌（S.Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体（短菌丝），作为种子。,试管三角瓶摇床种子罐,2、厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等）,试管三角瓶卡式罐种子罐,二、生产车间种子制备,实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。,1、种子罐的作用,主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。,2、种子罐级数的确定,种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数。,种子罐级数取决于：,菌种生长特性（如菌种传代后的稳定性）、孢子发芽及菌体繁殖速度；,所采用发酵罐的容积,另外还与发酵罐中种子培养液的最低,接种量（种子液体积,/培养液体积）,以及种子罐与发酵罐的容积比等有关。,细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。,茄子瓶种子罐发酵罐,霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵,孢子悬浮液一级种子罐（,27,C,40,小时孢子发芽，产生菌丝）二级种子罐（,27,C,1024,小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）发酵罐,放线菌：生长更慢，采用四级发酵,酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子 （二级发酵）。,确定种子罐级数需注意的问题,种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会,种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会,虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。,3.2 种子质量的控制,一、影响孢子质量的因素及控制,培养基,培养条件,培养时间和冷藏时间,1、培养基,生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象其主要原因是原材料质量波动。,例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。,蛋白胨加工原料不同如鱼胨或骨胨对孢子影响也不同。,原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素,Mg,2+,、Cu,2+,、Ba,2+,能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。,水质的影响：地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。,菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。,措施,培养基所用原料要经过发酵试验合格才可使用,严格控制灭菌后培养基的质量,斜面培养基使用前，需在适当温度下放置一定时间,供生产用的孢子培养基要用比较单一的氮源，作为选种或分离用的培养基则采用较复杂的有机氮源,2、培养条件,（,1）温度,温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。如土霉素生产菌种在高于37,C培养时，孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。,（,2）湿度,制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：,在北方气候干燥地区孢子斜面长得较快，,在含有少量水分的试管斜面培养基下部孢子长得较好，而斜面上部由于水分迅速蒸发呈干疤状，孢子稀少。,在气温高含湿度大的地区，斜面孢子长得慢，,主要由于试管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。从表中看出相对湿度在,40%45%时孢子数量最多，且孢子颜色均匀，质量较好。,3、培养时间和冷藏时间,（,1）培养时间,一般来说，,衰老的孢子不如年轻的孢子,，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。,措施：孢子培养的时间应该控制在,孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常,的阶段终止培养。,（,2）冷藏时间,斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。,如土霉素生产菌种孢子斜面培养,4天左右即于4,C冰箱保存，发现冷藏78天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。,冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。,例如在链霉素生产中，斜面孢子在,6,C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。,4、接种量,接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。,二、影响种子质量的因素及控制,孢子的质量,培养基,培养条件,种龄,接种量,1、培养基,营养成分适合种子培养的需要,选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；,营养上要易于被菌体直接吸收和利用；,营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高,营养成分要尽可能与发酵培养基相近。,2、培养条件,（1）温度,（2）通气量,（3）pH,3、种龄,种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。,不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。Ru 嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶，12小时最好。,4、接种量,接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。,通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%,三、种子质量的控制措施,种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。,菌种稳定性的检查,无杂菌检查,四、种子质量标准,1、形态,单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；,霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。,2、生化指标,种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化3、产物生成量,在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。,4、酶活力,种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。,五、种子异常分析,菌种生长速度，过快或过慢,菌丝结团,菌丝粘壁,第四节 菌种的保藏与复壮,一、菌种保藏的意义,菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。,二、菌种保藏的原理,菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状态，抑制其繁殖能力。,一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。,菌种保藏的方法很多，,一般有下面几种,：,A 斜面冰箱保藏法（酵母）,斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法,，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在,4冰箱保存。一般保存期为三个月到六个月,。,B 石蜡油封存法（酵母）,向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要,高出斜面一厘米,，然后保存在冰箱中。此法可,通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存,。,保存期约一年左右。,三、菌种保藏的方法,C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌）,这是国内常采用的一种方法。适合于,产孢子或芽孢,的微生物。它的,制备方法,是：,首先，将沙与土,洗净烘干过筛,后，,按沙与土的比例为,l2l混合均匀,，分装于小试管中，装料高度约为,1厘米左右,，,121C间歇灭菌三次,，灭菌试验合格后烘干备用。一般,沙用,80目过筛,，,土用,30100目过筛,。其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下,直接与沙土混合,，于干燥器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般,保存期为,1年左右,。,D真空冷冻干燥保藏法（,细菌，防线菌）,真空冷冻干燥保藏法,是目前常用的较理想的一种方法。其,基本原理,是在较低的温度下,（,15）,，快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使,水分升华,。在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。,因此，菌种可以保存很长时间，,一般,5年左右,。这种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外都已较普遍地应用。,这种方法的,基本操作,过程是先将微生物,制成悬浮液,，,再,与保护剂混合,，然后放在特制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在,低温下用真空泵抽干,，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。,保护剂一般采用脱脂牛奶或血清,。,保护剂的作用可能是在冷冻干燥的,脱水过程中代替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型,，,防此细胞膜因为冻结而破坏,。,保护剂还可以起,支持作用,，使微生物疏松地固定在上面。,E 液氮超低温保藏法（,细菌，真菌）,液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，,是适用范围最广的微生物保藏法,。尤其是一些,不产孢子的菌丝体,，,用其它保藏方法不理想，可用,液氮保藏法,。其保存期最长。,a 原理,用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达,一,196,，远远低于其,新陈代谢作用停止的温度（一,130）,，所以此时菌种的,代谢活动已停止,，,化学作用亦随之消失,。,b 操作方法及步骤,（,1）,安瓿管要求,由于液氮保存于超低温状态，所使用的,安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂,，一般用,95料或GCl7的玻璃管,，安瓿管选好后,印上标记,，,加棉塞后灭菌，烘干后备用,。,（,2）,菌种准备及分装,因为液氮法菌种要经受,超低温的冷冻过程,。所以也需要,保护剂,，常用的,保护剂为,10甘油,。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为,0.21mL,。,（,3）冻结,液氮法的,关键,是,先把微生物从常温过渡到低温,。这样在细胞,接触低温前,，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞,。,美国,ATCC采用,先将菌液降温到,0,，再以,每分钟降低,1的速度,，,一直降低到,38,，然后才把装有菌液的安瓿管放入,液氮罐的气相中,。由于液氮要蒸发，这样温度就会上升，,冰晶状态发生变化,，从而导致菌种死亡。所以要,常常注意液氮的残存量，定期补加,。,（,4）重新培养,当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出，,室温或,3540水浴中迅速解冻,，当,升温至,0时即可打开安瓿管,，将菌种移到适宜的培养基斜面上培养。,我国国内目前已有,部分单位采用液氮法保存菌种,。,四、菌种的衰退与复壮,1、,菌种衰退,菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。,菌种退化的原因,基因突变；,变异菌株性状分离；,诱变的单菌落是由,个以上孢子或细胞形成,菌落由,个孢子或单个细胞形成，但它是多核细胞,单核孢子发生突变时，双链,DNA,上仅,条链上某个位点发生变化,连续传代,其它因素,菌种保藏不当,生长条件不满足（培养基组成、培养条件）,防止菌种退化的措施,控制传代次数,选择合适的培养条件,选择合适的保藏方法,菌种稳定性检查,分离复壮,2、菌种复壮,使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性。,复壮措施：,对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化,淘汰衰退的个体,选择合适的培养基,思考题,1、名词解释,多因素低剂量的诱变效应、互变异构效应、染色体畸变、基因突变、表型延迟、营养缺陷型、杂交育种、原生质体融合、原生质体再生、菌种的扩培、接种量、菌种退化、菌种复壮,2、采集土壤微生物样品时应该注意哪些问题？,3、什么是增殖培养？为什么要进行增殖培养？,4、土壤中分离纯化微生物的方法有哪些？请简述之。,5、什么是微生物的初筛？请例举两种初筛方法，并简述之。,6、菌种保藏的原理是什么？常见的军种保藏方法有哪些？,7、菌种退化的原因有哪些？简述防止菌种退化的措施。,8、常见的菌种复壮措施有哪些？,