免疫学补体参和反应T细胞数量和其功能检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。,Part I,补体参与的反应,补体的溶血反应,Part II,T,细胞数量及其功能检测,E,花环形成试验,数量测定,淋巴细胞转化试验：,形态学方法,3,HTDR,掺入法,MTT,比色法,功能,补体激活的三条途径,经典途径,MBL,途径,旁路途径,IC+C1q,MBL+,病原体配基细菌,+C3,膜攻击复合物,细胞溶解,Part I,补体参与的反应,复习,1.,补体的溶血反应,原理,绵羊红细胞（,SRBC,）作为抗原与其相应抗体,（溶血素）,结合后，通过经典途径激活补体，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生,溶血反应,。,材料,1,抗原：,2%,绵羊红细胞；,2,抗体,(,溶血素,),；,3,补体：健康豚鼠新鲜血清,4,生理盐水、,24,孔板等。,孔号,SRBC,溶血素,补体,NS,1,3,滴,3,滴,3,滴,3,滴,2,3,滴,3,滴,6,滴,3,3,滴,3,滴,6,滴,4,3,滴,9,滴,步骤,1,、取,24,孔板，按下表加入各成分；,2,、将,24,孔板放在,37,温箱内,15-30min,，观察并记录结果。,结果,:,Part II,T,细胞数量及其功能检测,2.E,花环形成试验,原理,人外周血,T,细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞,(SRBC),表面糖肽相结合的受体,E,受体（,CD2,分子），可结合,SRBC,形成花环样细胞团，是,T,细胞特有的表面标志。,检测,T,细胞数量，间接判断机体的细胞免疫状况。,材料,肝素抗凝血、绵羊红细胞,(SRBC),淋巴细胞分层液、,Hanks,液、,1640,培养液、,0.5,戊二醛固定液、灿烂甲酚兰染液,试管、滴管、离心机、微量移液器、玻片、显微镜等,步骤：,（动作轻柔；分清滴管及枪头！）,取肝素抗凝血与等量,Hanks,液稀释混匀血,3ml,，用,滴管贴管壁（倾斜,30,）轻轻,叠加于,3ml,分离液上,（界面要清晰）,配平后,1800rpm,离心,13mins,。,1.,淋巴细胞悬液的制备：,人淋巴细胞比重：,1.070,淋巴细胞分层液：,1.077,人红细胞比重：,1.092,稀释的血液,分层液,离心前,稀释的血浆,单个核细胞,分层液,粒细胞,红细胞,离心后,另取一支滴管，,仔细,吸出位于血浆和分离液之间的,乳白色的单个核细胞,，放入盛有,5mlHanks,液的试管,2000rpm,离心,5mins,。,(3),弃上清（,倾倒时液体不要回流,），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入,Hanks液,5ml,，,重复离心两次。,2.,弃去上清，留经过洗涤的,淋巴细胞悬液,（约,0.1ml,）与,绵羊红细胞,0.1ml,、,1640,营养液,0.1ml,混合（,分清枪头,）,轻弹混匀后放于,37,温箱,15mins,。,离心时要配平,3.,取出试管，,500rpm,离心,5mins,。（注意此步非常关键，,转速一定要慢，一启动即关，来回数次即可,）,室温静置,2-3,mins,4.,吸去,100-150ul,上清液，轻轻,旋转混匀,，,沿管壁,滴加,1,滴,(50ul),戊二醛，轻轻混匀静置,5mins,。,5.,取一滴（,25ul,）液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。,6.,高倍镜下观察，计数,100,个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合,3,个,SRBC,者为,E,花环阳性。,正常参考值：,EtRFC,：,64.46.7,；,EaRFC,：,23.63.5,；,EsRFC,：,3.32.6,结果,T,淋巴细胞,SRBC,淋巴细胞转化试验,原理,T,细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原,(,如,PHA,、,ConA),或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称,淋巴细胞转化现象,。淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。,三种方法,形态学方法、,3,H-TdR掺入法、,MTT,比色法,根据胞核的大小、核与胞浆的比例、胞浆染色性、核的构造与核仁的有无。,成熟小淋巴细胞：,核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性；,过渡型淋巴细胞：,大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁；,淋巴母细胞：,体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁,1,2,个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡；,其他细胞：,中性粒细胞在培养,72,消失后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。,形态学方法,：,镜下观察,淋巴细胞转化试验,淋巴细胞转化率：,转化的淋巴细胞,转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞,100,正常参考值：,80,红细胞,未转化淋巴细胞,转化的淋巴细胞,淋巴细胞转化实验 瑞氏染色,1040,3,HTDR,掺入法,淋巴细胞转化试验,T,细胞受到,PHA,或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入,S,期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷,(,3,H-TDR),，可以被细胞摄入而掺入,DNA,中，通过,-,液体闪烁计数器,测定,3,H-TDR,的掺入量，判断细胞的增殖程度。,MTT,比色法,淋巴细胞转化试验,MTT,为一种黄色可溶性物质，细胞活化增殖时通过,线粒体能量代谢,，将,MTT,代谢成蓝紫色的,甲臢,，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于,酶标仪下,根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。,MTT,F,ormazan,Insoluble,1.,补体溶血反应的原理、步骤、结果及分析。,2.E,花环形成试验的原理、步骤、绘制镜下观察结果。,3.,绘制淋巴细胞转化试验（形态学法）镜下观察结果。,实验报告,第,4,次 实验课内容,免疫标记技术：,ELISA,免疫病理实验,实验课考试,