细胞生物学的研究方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,显微技术,分辨率可达,0.2m,的,光学显微镜,分辨率可达,2nm,的,电子显微镜,提示蛋白质精确结构的,X,线衍射,测定大分子结构的,核磁共振,光学显微镜,1.,普通光学显微镜,2.,荧光显微镜,3.,相差显微镜,4.,暗视野显微镜,5.,显微电影摄影,6.,共聚焦激光扫描显微镜,1.,普通光学显微镜,普,通,双,筒,显,微,镜,(1),分辨率,(resolution,，,R):,显微镜或人眼在,25cm,的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。,0.61,R,n,sin,光学显微镜的参数,数值孔径,(numeric aperture,),N,A,sin,R,0.61/n,sin,n:,聚光镜和物镜之间,介质的折射率,.,空气为,1,油为,1.5,:,标本对物镜镜口,张角的半角,.,sin,的最大值为,1,:,照明光源的波长,.,白光为,0.5 m,光学显微镜最大分辨率计算：,Rmax,0.61,/n,sin,0.610.5,m/1.51,0.2,m,(2),最大放大倍数,人眼的分辨率：,100,m,典型的动物细胞：,10,20,m,一般的细菌和线粒体：,0.5,m,=,500,倍,2.,荧 光 显 微 镜,1,2,3,1,3-,滤光镜，,2,分光镜,原理,:,荧光分子在受到光照射后，可吸收特定波长的短波光线，并发射出比原来吸收波长更长的光。,绿色荧光蛋白,GFPgreen fluorescent protein,2008,年的诺贝尔化学奖授予了从事有关,“,绿色荧光蛋白质的发现,图示：,鼠主动脉平滑肌细胞,核,:blue,线粒体,:green,肌动蛋白,:red,DAPI,，,FITC,，,Rhodamin,免疫荧光显微镜技术（,Immunofluorescence microscopy,）,原理,:,荧光抗体与标本切片中组织或细胞,的抗原进行反应，在荧光显微镜下,可观察到明亮的特异荧光。荧光素标记抗体的方法,直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。,间接法：荧光素先和第二抗体,(,抗第一,抗体的抗体,),偶联，再与第一抗体作用。,3.,相差显微镜（,直视活细胞,）,1.,由荷兰科学家,P,Zernike,于,1935,年发明,1953,年诺贝尔物理奖,2.,特点,:,可用以观察活细胞。,3.,原理,:,波长 色彩,振幅 亮度,速度 相位,细胞内的各结构可因密度不同而产生,即光程差,(,或相位差,),，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种,“,光程差,”,变成,“,振幅差,”,，,明者更明，暗者更暗，立体感增强。物镜中增加一环形相板，光源聚光器中增加一环形光阑。,4暗视野显微镜（观察物体轮廓）,在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的,丁达尔现象,。,制造暗视野显微镜的灵感,原理,:,利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，,故呈暗视野。,只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。,主要观察物体的轮廓，分辨不清内部的微细构造，适合观察,活细胞内的细胞核、线粒体,以及液体介质中的细菌等微粒的运动,5.,显微电影摄影,记录细胞或细胞器运动过程和速度,用显微电影摄影术或电视录像以一定,间隔拍摄一次细胞状态，当影片或电视,录像以正常速度反映时，所拍摄的情节,就被大大加快了，用这种方法可以准确,地记录细胞或细胞器的运动过程和速度。,6.,激光共聚焦扫描显微镜,原理：,用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。类似荧光显微镜，但能扫描不同 层次，形成立体图像。,b1,b2,b3,1.,透射电子显微镜,2.,扫描电子显微镜,3.,扫描探针显微镜,电子显微镜,1.,透射电子显微镜,透射电镜的成像原理,电子束通过标本时，根据标本各部位密度的不同，部分电子发生散射，只有剩余的电子成像，经物镜和投射镜放大后投射到照相底片或荧光屏上。,由于散射的电子不参加成像，故标本中密度大的部分成像后形成电子流量减少的暗区；相反密度小的部分散射电子少而形成明区。,分辨率：,理论上,d=0.002 nm,实际上,d=0.1 nm,生物标本,d=2 nm,放大倍率,1,000,000,2.,扫描电子显微镜,20,世纪,60,年代问世，用来观察标本表面结构。,分辨力为,610nm,，由于人眼的分辨力为,0.1mm,，扫描电镜的有效放大倍率为,0.1mm/10nm=10000X,。,成像原理,工作原理：,用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，由探测器收集次级电子，荧光屏上成像,a.,样品表面形貌,表面越突出，图像越亮,表面越凹陷，图像越暗,b.,样品与集电器的关系,面向集电器，图像越亮,背向集电器，图像越暗,扫描电镜的特点,高的分辨率,很强的立体感,样,品,适,应,性,大,应用范围广,（三）扫描探针显微镜,光学显微镜电子显微镜,扫描探针显微镜,分辨率在纳米水平，可直接观察单个原子，也称纳米显微技术,代表：,扫描隧道显微镜,和,原子力显微镜,细胞化学技术,细胞化学技术（,cytochemistry technique,）：在保持细胞结构完整的条件下，通过细胞化学反应分析细胞内各种成份（如生物大分子、小分子、无机离子等）的分布情况以及这些成份在细胞活动过程中的动态变化，即对细胞内的化学成分进行定位、定性和定量分析，从而研究细胞乃至细胞器的结构和功能的关系以及细胞的生理和病理现象的分析技术。,包括,酶细胞化学技术,、,免疫细胞化学技术,、,原位杂交技术,、,放射自显影技术,等。,基于光镜和电镜的显示技术,一酶细胞化学技术,通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。,基本原理,：将酶与其底物共同孵育，然后使产物与显色剂反应生成荧光分子、有色可溶性化合物、有色沉淀或高电子密度沉淀，最后通过光度计、光镜、电镜等进行检测和观察。,抗体示踪技术,A.,抗体,+,荧光素,LM(,免疫荧光显微镜,),B.ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay),抗体酶,酶,酶,底物,显色,待测抗原,1,）首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中,28,下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不牢固的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明胶等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。,2,）加入含待测物的临床样本如血清（浆）等，温育（通常为,37,下）一定时间后，洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体结合而吸附于固相上。,3,）加入酶标记的双抗体之二，温育（通常为,37,下）一定时间后，洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。,4),加入酶底物，温育（通常为,37,下）显色测定。,例：,抗体,（四）原位杂交技术（,in situ hybridization,）,原理,：用标记的核酸探针对细胞中,DNA或,RNA,序列在其原位进行杂交。目的是对被杂交的核酸分子进行定位、定量分析或观察基因表达的水平。,步骤,：,1,、制备带有放射性同位素标记的,DNA,或,RNA,分子探针。,2,、将探针与组织或细胞在一定条件下共同孵育，使探针与待测的核酸单链结合（杂交）。,3,、利用放射自显影或免疫化学技术显示探针，从而获得,mRNA,表达的细胞及水平高低。,细胞的分离和分析技术,离心分离技术，如超速离心：细胞器、大分子,制备细胞匀浆,细胞,匀浆液,膜,细胞器,大分子,方法：,低渗透压,超声振荡,在细胞膜上打孔,强制通过微孔,机械破碎或研磨,离心技术：,1,、,差速离心,differential centrifugation,用于分离,大小、形状显著不同,的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离,2,、,速度沉降,分离密度相近而,大小形状有差异,的组分,3,、,等密度离心，,分离,大小、形态相似而,密度不同,的组分,2.,层析,分离蛋白质,(1),分配层析,纸层析：滤纸,薄层层析：薄层纤维素、硅胶板,柱层析,分离蛋白质,A.,离子交换层析,B.,凝胶过滤层析,电荷 大小,C.,亲和层析,D.,疏水性层析,亲和 疏水性,基质抗体 基质疏水基团,应用：,细胞分选,:,1000-5000cells/sec,原理：,用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞，然后在流式细胞仪中选出标记细胞。,流式细胞术,4.,电泳,分析蛋白质、核酸,(,1),原理,氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳。,(2)SDS-PAGE,根据蛋白质分子量、亚单位组成等,样品处理,:,SDS(,十二烷基硫酸钠,),、,2-,巯基乙醇,/,二硫苏糖醇,(DTT),*,支持体,:,单体丙烯酰胺、聚丙烯酰胺凝胶,*染 色,:,考马斯亮蓝、特异性蛋白,(western blotting),Western-blotting,印迹技术,将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测,.,基本步骤,:,(1)SDS-PAGE,(2),转膜,(3),抗体反应，一抗孵育，标记二抗孵育,(4),显色,（,2,）,Southern blotting,DNA,probe,细胞中的,DNA,是体外分析特异,DNA,序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核,DNA,或线粒体,DNA,切成,DNA,片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷酸序列。,（,3,）,Northern blotting,RNA,细胞中的,RNA,probe,将,RNA,转移到薄膜上，用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷酸序列。,细胞培养技术,原代培养,(primary culture):,直接从生物体获取细胞进行培养。,10,代,传代培养,(secondary culture),：将原代培养的细胞连续以一定比例扩大培养。正常组织的细胞在体外传代不超过,50,代。,细胞系,(cell line),：原代培养细胞经传代成功后即为细胞系。,细胞株（,cell strain,）：当培养细胞具有某些特征与标志并能继续培养下去时（具有特定性质或标志的细胞群）称为细胞株。,克隆（,clone,）：指由同一个祖先细胞通过有丝分裂产生的遗传性状一致的细胞群。也称无性系,.,细胞融合：又称细胞杂交，是指细胞彼此接触时，,2,个或,2,个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。结果：可形成双核或多核的细胞。,（一）细胞培养的类型和方法,表,2-2,目前实验室常用的几种细胞株,p20,(,二,),细胞培养的基本条件,.,营养条件：培养基、血清,.,环境要求：无菌、抗生素；,37,、,5,CO,2,、,95,100,湿度,.,支持物,第二节细胞生物学其它研究方法,p20,