复件 微生物检测-第五章3.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三节 金黄色葡萄球菌,(,Staphylococcus,aureus,),检查法,是最常见的化脓性球菌，需氧或兼性厌氧,食物中毒:火腿加工肉制品冰淇淋沙拉等,化脓性感染:规定外用药及一般滴眼剂不得检出本菌。,一、生物学性状,金黄色葡萄球菌能产生多种毒素及酶，这些毒性物质是它致病力强的物质基础，能引起局部及全身化脓性炎症，严重时可发展成为败血症及脓毒血症，是人类化脓性感染中最重要的病原菌。,球形，大小不一，直径为0.4-1.2,m，,平均为0.8,m。,无鞭毛，无芽孢。不形成荚膜。,在固体基质上，常堆聚成葡萄串状。,在液体培养基中，呈双、呈链状排列。,革兰染色阳性；当衰老、死亡或被中性粒细胞吞噬后常转为阴性。,（一）形态与染色,（二）培养特征,菌落0.8-1.5,mm，,圆形不透明、边缘整齐、光滑,最适温度37，最适,pH7.4。,需氧或兼性厌氧，在20%-30%,CO,2,环境中有利毒素产生。,耐盐，在10%-15%的氯化钠培养基中能生长。,在营养琼脂平板上产生金黄色脂溶性色素。,在血琼脂平板上，菌落较大，且产生全透明溶血环。,在卵黄高盐琼脂平板上分解卵磷脂在菌落周围形成白色乳浊圈。,（三）生化反应,糖发酵产酸不产气,甲基红阳性，,v-P,阳性，吲哚阴性,尿素酶阳性，还原硝酸盐，液化明胶,产血浆凝固酶，耐热,DNA,酶和精氨酸双解酶，有时产生磷酸酶和触酶,（四）抗原构造,1.,蛋白质抗原,（,staphylococcal protein A，SPA）：,有种属特异性，存在于细胞表面，是细胞壁的主要成分，能和人和动物血清中的,IgG,结合，具有抗吞噬作用，能促使细胞分裂。90%以上菌株具有此抗原。,2,.,多糖抗原,：是半抗原，具有型特异性。分为：,（1）,甲,型多糖抗原：从,S.,aureus,中提出，磷壁酸中的,N-,乙酰葡萄糖胺核酸醇残基,（2）乙型多糖抗原：非致病葡萄球菌中提出，磷壁酸中的,N-,乙酰葡萄糖胺甘油残基,（3）丙型多糖抗原：由多型葡萄球菌中提出,（五）抵抗力,抗干燥,在60-701,h,才能被杀死，8030,min,能存活,在5%苯酚或0.1%升汞溶液10-15,min,才杀死,耐高盐,对红霉素、链霉素、庆大霉素、先锋霉素敏感,90%以上菌株对青霉素有耐药性,（六）致病性,侵袭力,invasiveness,：,溶血毒素（,hemolysin,staphylolysin,）:,是一种外毒素，不耐热。有,四种。,溶血毒素：,对人类有致病作用的是,溶血毒素，对红细胞有溶血作用，能损伤血小板和血管平滑肌。,溶血毒素：在培养基上产生，具溶血活性。,、,溶血毒素：抗原性有差异,溶血毒素,杀白细胞素（,leucocidin,）：,能杀死动物白细胞，具有抗原性。,肠毒素（,enterotoxin,）：,引起急性胃肠炎，对热稳定，有,A、B、C、D、E,五型。,A,型引起的食物中毒最多。,剥脱性毒素（,exfoliative,toxin）：,可引起人和鼠表皮剥脱性病变。,凝固酶（,coagulase,）：,一般致病性葡萄球菌产生此凝固酶，可分为两种：,结合凝固酶（,bound,coagulase,）：,直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，凝集成块。,游离型凝固酶（,free,coagulase,）：,不直接作用于血浆中纤维蛋白原，而是和一种凝固酶反应因子结合，形成一种稳定复合物，作用于纤维蛋白原，使血浆凝固。,其他物质：产透明质酸酶，皮肤坏死毒素、耐热,DNA,酶和精氨酸双解酶，有时产生磷酸酶和触酶、红疮毒素、溶纤维蛋白酶等。,二、常规检查法,增菌培养：取1：10的检样稀释液，放至营养肉汤中培养18-24,h。,分离培养：将增菌液用接种环沾取1-2环，划线接种于卵黄高盐琼脂平板或甘露醇高盐平板、血琼脂平板上。36培养24-72,h。,卵黄高盐琼脂：金黄色，菌落1-2,mm，,圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有乳浊圈。,甘露醇高盐平板：金黄色，菌落0.7-1,mm，,圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有黄色环。,血琼脂平板上：金黄色，菌落2-4,mm，,圆形凸起、边缘整齐、光滑湿润、外周有透明溶血环。,菌落圆形,表面光滑、凸起、湿润直径,2,3mm,。,灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色,(,非白色,),的边缘,周围绕以不透明圈,(,沉淀,),其外常有一清晰带。,当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。,从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。,Baird-Parker,琼脂平板,在传统的,Baird Parker,基础中加入,(,兔血浆,+,纤维蛋白原试验,),。培养后，在菌落周围出现大而清晰的“光晕“即可证实该葡萄球凝固酶为阳性。,在,24,小时的培养过程中，同时进行了选择性的分离培养和凝固酶试验。与传统的“,Baird Parker,琼脂,+,蛋黄”观察脂酶活性相比，凝固酶的产生是一个更加特异的鉴定葡萄球菌的试验。,纯培养：挑取上述菌落2-3个，接种于营养肉汤琼脂斜面上，36培养18-24,h，,取培养物进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。,革兰氏染色镜检：革兰染色阳性球菌。无芽孢、无荚膜、排列呈不规则的葡萄状，单个、成双或成链状排列。,血浆凝固酶试验：,血浆制备：以无菌手续自家兔心脏采血9,mL,，,迅速加至装有5%柠檬酸钠溶液1,mL,的灭菌离心管内，充分混合数分钟后，1500,r/min,离心15,min，,吸取血浆备用。,玻片法测结合凝固酶,取载玻片一张，在玻片两端分别滴上灭菌生理盐水和未经稀释的血浆各一滴。,取待检菌18-24,h,肉汤液或琼脂培养物一接种环，加至生理盐水中，制成浓菌悬液，取一环，与血浆混合均匀，观察结果。,在5,min,内混菌的血浆出现团块或颗粒状凝块，而在盐水中呈均匀混浊时，即为阳性反应。同时做阳性对照和阴性对照。,载玻片,生理盐水,血浆,待检培养物,试管法测游离凝固酶,取灭菌小试管3支，各加血浆0.5,mL,；,一支加入待检菌生理盐水悬液或营养肉汤液0.5,mL,，,为试验管,另一支加阳性对照菌生理盐水悬液或营养肉汤液0.5,mL,，,做阳性对照管；,再一支加生理盐水悬液或营养肉汤液0.5,mL,，,做阴性对照管。,三管同时放37水浴中4,h每隔1,h,观察一次结果,，不要振动或摇动试管，轻轻倾斜至横放，检查各管是否凝固或有凝块。,若无凝固或凝块现象，则育孵,24h，,再检查。,待检,阳性对照,阴性,对照,37,水浴,4h,注意事项,试管法和玻片法结果可能不一致，玻片法的阴性和可疑结果用试管法确定。,玻片法的待检菌悬液应较浓，避免假阴性,纤维蛋白溶酶的产生，每小时观察,新鲜培养物，否则凝固酶活性低，不易检出,结果判定,革兰氏染色镜检阳性球菌，血浆凝固酶阳性，判为检出金黄色葡萄球菌,革兰氏染色镜检不是阳性球菌，或血浆凝固酶阴性，判为未检出金黄色葡萄球菌,阴性对照有菌生长或阳性对照呈阴性结果时，重新检查,三、其他鉴别试验,溶血试验法取5,mL,无菌的脱纤维血，加在100,mL,溶化并冷却至50的营养琼脂里，混匀后倾注平板。烘干冷凝水，备用。用接种环取微同待测菌，划线于平板上，37 18-24,h,观察溶血环。,肠毒素测定,动物实验法,ELISA,法,反向乳胶凝集法,磷酸酶试验,原理：致病型葡萄球菌可产生磷酸酶，使单磷酸水解，如以磷酸酚酞为基质，则水解后可释放出酚酞，在碱性环境中呈红色。,方法：在1000,mL,营养琼脂内加入1%的磷酸酚酞溶液1,mL,，,倾注平板，接种待检菌，3518-24,h，,在平板上滴加浓氨水，菌落变为红色，则为阳性。,耐热,DNA,酶试验：,原理：金黄色葡萄球菌所产生的,DNA,酶加热煮沸后仍具有酶活性。可水解长链,DNA,成寡聚核苷酸，后者遇甲苯胺蓝后变成粉红色。,（1）玻片法：将溶化好的,Tris,DNA,琼脂3,mL,铺于灭菌的载物玻片上，放在水平台上待琼脂凝固，用直径3,mm,打孔器打孔3-4个。将待检菌肉汤培养物10020,min,处理后冷却，于每孔中加入1小滴363,h,后观察。出现大于5,mm,粉红色圈者为阳性。,（2）平板法：在分离金黄色葡萄球菌的琼脂平板上挑选并标记所需要测试的菌落，之后在60干燥箱内放2,h，,取出后在平板上倾注10,mL,TrisDNA,琼脂。凝固后363,h,后观察结果，在标记菌落周围呈粉红色圈为阳性。,链球菌检测,触酶试验,将待检菌接种于营养琼脂平板上，35,24,h，,取3%双氧水0.5,mL,，,滴加于菌苔表面，半分钟内产气泡者为阳性，不产生为阴性。区别于链球菌(-),注意,：不能用浓双氧水,不能用血平板,必须用新鲜培养物。,杆菌肽试验,淀粉酶试验,胆汁七叶苷试验,