液相色谱实验技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高效液相色谱实验技术,RP-HPLC,分析,方法的建立,1,反相色谱最常用、最经济、最简便,2,最常用的反相柱是,C18,柱,3,适用非极性、弱极性、中等极性物质的分离,4,强极性化合物可衍生化转为可分离物质,5,其他色谱柱（,C8,、,C1,、苯基、,-CN,、,-NH2,正相柱）,如何卓有成效的工作,1,首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性）,2,设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。,3,预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。,如何卓有成效的工作,4,优先考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。,5,应对每次实验进行设计，能提供有用信息。,6 HPLC,的目的是分离，而不必使所需谱峰,“,过渡分离,”,。,分析方法的建立和优化,绝大多数情况下，,HPLC,方法的建立主要靠经验进行,1,获得合适的保留时间，,2,t,0,t,R,静电力,诱导力,色散力,在反相色谱中，固定相非极性。,样品分子极性越大，保留时间越短，出峰越快；分子体积越大、分子量越大，保留时间越长，出峰越慢；,分子中增加烷基、芳香基、,-Br,、,-I,基团，分子极性降低，保留时间增长；,分子中增加极性基团，分子极性增大，保留时间缩短；如：,-NO,2,、,-SO,3,HF,、,-NH,2,、,-COOH,反相色谱流动相：水,+,有机溶剂,最常用有机溶剂：甲醇、乙腈、四氢呋喃,溶剂极性越小，样品分子保留时间越短，出峰越快；,流动相中有机溶剂比例越大，保留时间越短；,流动相中有机溶剂极性越小，保留时间越短。,由于乙腈、,四氢呋喃,的毒性，通常优先考虑“甲醇,H2O”,流动相,分离度与溶剂强度的关系,流动相,pH,、缓冲溶液浓度可显著改变分离度；,试样分子含可解离的基团时，流动相要用一定,pH,的缓冲溶液，这样可避免出现不对称的峰和分叉的峰，提高保留时间的重复性。,酸性试样，采用偏酸性缓冲溶液，碱性试样选用偏碱性缓冲溶液，这样可抑制试样解离，提高分离效率。缓冲溶液应具有以下一些性能：,(1),在,pH=28,之间要有大的缓冲容量；,(2),能透过检测器使用的光波；,(3),能和有机溶剂相溶；,(4),能促进平衡速度的提高；,(5),可以掩蔽吸附剂表面上的硅醇基。,困难样品：多员梯度,复杂样品的分析,梯度洗脱,一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的溶剂强度的流动相，使样品充分分离，通过分析谱峰，简化分确定离条件的步骤,建议用乙腈,/,水作流动相进行首次分离,乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长宽：可在,185,205nm,检测,其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四氢呋喃,等梯度反相分离,优化梯度方法的步骤,1,选择标准梯度条件进行首次实验,乙腈,/,水,5,95,25min,2ml/min,或,乙腈,/,水,5,95,50min,1ml/min,2,调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费,起始条件，使最初几个组分有足够保留和分离,终止条件，使最后几个组分完全出峰、完全分离。,3,溶剂的梯度范围尽可能小,4,如果色谱峰复杂，分离较差：,延长梯度时间,加长柱长,使用细粒度的柱,降低流速以提高塔板数,5,一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距,6,需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂,