第4章-蛋白质的共价结构.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二单元 蛋白质化学,第,3,章 氨基酸,4,第,4,章 蛋白质的共价结构,2,第,5,章 蛋白质的三维结构,2,第,6,章 蛋白质分子结构与功能的关系,2,第,7,章 蛋白质分离、纯化和表征,4,第,4,章 蛋白质的共价结构,一、蛋白质通论,二、肽,三、蛋白质一级结构的测定,四、蛋白质氨基酸序列与生物功能,五、肽与蛋白质的人工合成,一、蛋白质通论,（一）蛋白质的化学组成和分类,（二）蛋白质的形状和大小,（三）蛋白质分子的构象与结构层次,（四）蛋白质功能的多样性,2.,蛋白质的结构组成,(Proteins building-block units),蛋白质,(Pr),分子量很大，可水解成简单有机化合物,氨基酸（,amino acids),，氨基酸按固定的排列顺序以共价键的形式连接形成长的不分支的链。,蛋白质是由多肽组成的。,蛋白质：分子量,6000,时，有完整的生物学功能，至少,40,个,aa,。,多肽：分子量,6000,时，不完全有生物学功能,。,3,、蛋白质的水解,(Hydrolysis of proteins,),酸水解：,6N HCl,煮沸回流,20,小时左右,或加压于,120C,水解,12,小时,.,优点,:,水解彻底,水解的最终产物是,L-,氨基酸,没有旋光异构体生成,.,缺点,:,色氨酸全部破坏,丝,苏,酪氨酸部分破坏,.,有腐黑质生成,碱水解,:,6M NaOH,或,4M Ba(OH)2,煮沸,6,小时,.,优点,:,色氨酸不被破坏,水解液清亮透明,.,缺点,:,水解产生的氨基酸发生旋光异构作用，,产物中有,L-,D-,型,两类氨基酸,酶水解：,蛋白质可以由蛋白酶水解，不同的蛋白酶专一性不同。,优点,:,条件温和,氨基酸不破坏,无旋光异构体产生,.,缺点,:,各蛋白酶有不同的专一性,用单一的酶作用水解不彻底,.,4,、蛋白质的分类,(Classification of proteins),根据蛋白质的化学组成,简单蛋白质和结合蛋白质,根据蛋白质的溶解性和组成,根据蛋白质分子形状,球状蛋白质和纤维状蛋白质根据蛋白质生物功能,活性蛋白质和非活性蛋白质,按分子组成分类,1.,单纯蛋白质 完全由氨基酸组成，不含非蛋白成分。根据溶解性的不同，可将简单蛋白分为以下,7,类。,2.,结合蛋白（又称缀合蛋白）由蛋白质和非蛋白成分组成，后者称为辅基。根据辅基的不同，可将结合蛋白分为以下,7,类。,按分子形状分类,1.,球状蛋白,外形近似球体，多溶于水，大都具有活性，如酶、转运蛋白、蛋白激素、抗体等。球状蛋白的长度与直径之比一般小于,10,。,2.,纤维状蛋白,外形细长，分子量大，大都是结构蛋白，如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等。纤维蛋白按溶解性可分为可溶性纤维蛋白与不溶性纤维蛋白。前者如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等，后者如胶原蛋白，弹性蛋白，角蛋白等结构蛋白。,（二）蛋白质的形状和大小,蛋白质分子的形状：,球状蛋白,纤维状蛋白,膜蛋白,蛋白质分子的大小：,6000-10,6,表,4-4,（三）蛋白质分子的构象与结构层次,二、肽,(peptides),（一）肽和肽键及结构,（二）肽的理化性质,（三）自然界中存在的小肽,（一）肽和肽键及结构,1,、蛋白质通过肽键连接,2,、肽的定义与结构,一分子氨基酸的,-,羧基与另一分子氨基酸,-,氨基脱水缩合的化合物叫做肽，氨基酸之间通过酰胺键（蛋白质化学中将这类酰胺键专称为肽键）连接。肽是一大类物质，即：,1,）两个氨基酸组成的肽叫二肽；,2,）三个氨基酸组成的肽叫三肽；,3,）多个氨基酸组成的肽叫多肽；,4,）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链，肽链两端有自由,-NH2,和,-COOH,，自由,-NH2,端称为,N-,末端（氨基末端），自由,-COOH,端称为,C-,末端（羧基末端）；,5,）构成肽链的氨基酸已残缺不全，称为氨基酸残基；,6,）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般,-NH2,端开始，由,N,指 向,C,，即多肽链有方向性，,N,端为头，,C,端为尾。,4,、肽的书写,写法：从左右，从,N,末端,C,末端。,三字母用连线，也有用单字母的。,读法：,酰,酰,酸。,例：,Ser-Gly-Try-Ala-Leu,或,SGTAL,，,丝氨酰,甘氨酰,-,酪氨酰,-,丙氨酰,-,亮氨酸,结构式：,5,、肽键的特点,（,1,）肽键虽是单键却有双键性质，不能自由旋转,（,2,）肽键周围六个原子在同一平面（酰氨平面）上,（,3,）相邻两个氨基酸的,-carbon,在对角,(trans),，反式,（,4,）肽键亚氨基在,pH 0-14,内不解离。,7,、以肽键平面连接成多肽长链,多肽链可以看成由,C,串联起来的数个酰胺平面组成,（二）肽的物理化学性质,1,、旋光性,一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和，但较大的肽或蛋白质的旋光度不等于其组成氨基酸的旋光度的简单加和。,2,、肽的酸碱性质,短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形式存在肽的酸碱性质主要取决于,N,端,-NH,和,C,端,-COOH,以及侧链,R,上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。肽的滴定曲线和氨基酸的很相似。,3,、肽的等电点,可以根据它的,pK,值确定,（三）天然存在的活性肽,1,、谷胱甘肽,（,GSH,）,p168,三肽（,Glu-Cys-Gly,），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。,GSH,和,GS-SG,三、蛋白质一级结构的测定,（一）蛋白质一级结构的定义,（二）,N,末端分析,（三）,C,末端分析,（四）,二硫键的拆开和肽链的分离,（五）,肽链的完全水解和氨基酸组成的测定,（六）,肽链的部分水解和肽段的分离,（七）,多肽链中氨基酸顺序的测定,（八）,二硫键位置的确定,（一）蛋白质一级结构的定义,蛋白质的一级结构,是指肽链的氨基酸组成及其排列顺序和二硫键的位置。,氨基酸序列是蛋白质分子结构的基础，它决定蛋白质的高级结构。一级结构可用氨基酸的三字母符号或单字母符号表示，从,N-,末端向,C-,末端书写。采用三字母符号时，氨基酸之间用连字符,“,”,隔开。,1,、,N,末端分析,（,1,）,蛋白质的末端氨基与,2,4-,二硝基氟苯,(DNFB),（,Sanger,试剂）在弱碱性溶液中作用生成二硝基苯基蛋白质DNP-,蛋白质），产物黄色，可经受酸性,100,高温。水解时，肽链断开，,DNP-,氨基酸,能溶于有机溶剂（如乙醚）中，这样可与其他氨基酸和,-DNP,赖氨酸分开。,经双向滤纸层析或柱层析，可以鉴定黄色的,DNP,氨基酸。,1,、,N,末端分析,（,2,）,蛋白质的末端氨基与丹磺酰氯,(,DNS-Cl),反应，生成,DNS-,蛋白质。,DNS-,氨基酸有强荧光，激发波长在,360nm,左右，,比,DNFB,法灵敏,100,倍,。,肽水解后的,DNS-,氨基酸不需要提取。,1,、,N,末端分析,（,3,）末端氨基与,异硫氰酸苯酯（,PITC,）,在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在硝基甲烷中与酸作用发生环化，生成相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来。产物可用气,-,液色谱法进行鉴定。,Edman,法,此法是目前应用最广泛方法。,优点,是剩下的肽链仍是完整的，可依照此法重复测定新生的,N,末端氨基酸。现在已经有全自动的氨基酸顺序分析仪，可测定含,20,个以上氨基酸的肽段的氨基酸顺序。,缺点,是不如丹磺酰氯灵敏，可与之结合使用。,（,4,）,N,末端氨基酸也可用酶学方法即,氨肽酶,法测定。,N-,末端分析,常见问题及处理方法：,经常碰到,N-,末端残基的氨基被封闭。因此不能与,Edman,降解试剂发生作用。,焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。,2,、,C,末端分析1,）,C,末端氨基酸可用硼氢化锂,还原生成相应的,氨基醇。肽链水解后，再用层析法鉴定。有断裂干扰。,（,2,）多肽与肼在无水条件下加热,，可以断裂所有的肽键，除,C,末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的,C,末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。,（,3,）羧肽酶法,将蛋白质在,pH 8.0,30,与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道,C,末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶,A,水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶,B,水解精氨酸和赖氨酸。,3,二硫键的拆开和肽链的分离,肽链之间,不是共价交联,的，可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。,如果肽链之间以,二硫键,交联，或肽链中含有链内二硫键，则必须用氧化或还原的方法将二硫键拆开。,最普遍的方法是用过量的,巯基乙醇,处理，然后用,碘乙酸,保护生成的半胱氨酸的巯基，防止重新氧化。,二硫键拆开后形成的肽链，可用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法进行分离。,4,、肽链的完全水解和氨基酸组成的测定,在测定氨基酸顺序之前，需要知道多肽链的氨基酸组成和比例。一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。目前用氨基酸自动分析仪，,2,4,小时即可完成。,蛋白质的氨基酸组成，一般用每分子蛋白质中所含的氨基酸分子数表示。不同种类的蛋白质，其氨基酸组成相差很大。,5,、肽链的部分水解和肽段的分离,胰蛋白酶：,专门水解赖氨酸和精氨酸的羧基形成的肽键，所以生成的肽段之一的,C,末端是赖氨酸或精氨酸。,胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：,水解苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等疏水残基的羧基形成的肽键。其他疏水残基反应较慢。,以上方法中，酶不能水解,脯氨酸,参与形成的肽键,肽段的分离：,多肽部分水解后，降解成长短不一的小肽段，可用层析或电泳加以分离提纯。经常用双向层析或电泳分离，再用茚三酮显色，所得的图谱称为,肽指纹谱,。,酶法裂解总结,胰蛋白酶,Lys,X,Arg,X (X Pro),胰凝乳蛋白酶,Tyr,X,，,Trp,X,Phe,X (X Pro),6,、多肽链中氨基酸顺序的测定,从多肽链中部分水解得到的,肽段,可用,Edman,化学法、酶法、质谱法或气谱,-,质谱连用法测序，然后用小肽段重叠原理拼凑出整个,多肽链,的氨基酸顺序。,7,、二硫键位置的确定,一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。,常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（,pH2,），此时二硫键稳定。,肽段的分离可用,对角线电泳,pH6.5,过甲酸蒸汽断裂二硫键使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。,四、蛋白质氨基酸序列与生物功能,1.,同源蛋白质,在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质称,同源蛋白质,。,同源蛋白质一级结构（序列）的特点：,（,1,）同源蛋白质氨基酸序列具有明显的相似性（同源性）。,（,2,）多肽链长度相同或相近有,（,3,）许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称,不变残基,，不变残基高度保守，是必需的。除不变残基以外，其它位置的氨基酸对不同的种属有很大变化，称,可变残基,，可变残基中个别氨基酸的变化 不影响蛋白质的功能。,例如各种脊椎动物中血红蛋白和胰岛素。,胰岛素,由,51,个,aa,组成，,A,、,B,两条链（21+30,），,2,个链间二硫键，,1,个链内二硫键,有,24,个氨基酸残基位置始终不变：,6,个,Cys,不变，其余,18,个氨基酸多数为非极性侧链，对稳定蛋白质的空间结构起重要作用。,猪与人接近，而狗则与人不同，因此可用猪的胰岛素治疗人的糖尿病。,2.,同源蛋白质的物种差异与生物进化,细胞色素,C,，,通过分子中的半胱氨酸巯基与血红素共价结合,分子量：,12500,左右,氨基酸残基：,100,个左右，单链。,25,种生物中，细胞色素,C,的不变残基,35,个。,60,种生物中，细胞色素,C,的不变残基,27,个。,亲源关系越近的，其细胞色素,C,的差异越小。,亲源关系越远的，其细胞色素,C,的差异越大。,细胞色素,C,的氨基酸顺序分析资料已经用来核对各个物种之间的分类学关系，以及绘制进化树。根据进化树不仅可以研究从单细胞到多细胞的生物进化过程，还可以粗略估计各种生物的分化时间。,