基因工程第四章-工具酶.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Chapter Four,Manipulative Enzymes,Restriction,Endonuclease,S,ection one,核酸酶：指通过切割相邻的两个核苷酸之间的,3,5,磷酸二酯键，而引发核酸分子发生水解断裂的酶。按水解断裂核酸分子的方式不同，分为核酸内切酶和外切酶。,核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸，一个核苷酸地消化降解多核苷酸的酶。,核酸内切酶：从核酸分子的内部，切割磷酸二酯键使之断裂并形成小分子片断的酶。,限制性内切酶是核酸内切酶的一种。,The two different types of,exonuclease,It removes nucleotide from both strands of DNA,It removes nucleotide only from the 3 terminus,一、限制性内切酶的发现与种类：,1,、限制性内切酶的发现：,20,世纪,60,年代在研究细菌的限制和修饰现象时被,Linn,和,Arber,发现，他们研究的是大肠杆菌。大肠杆菌细胞可以降解噬菌体的,DNA,入侵，也就是在生物体可识别外源,DNA,，并将其降解，而保护自身的,DNA,不被感染。,W.,Arber,这就是在生物体内普遍存在的限制修饰现象。限制是,restriction,修饰,modification,所以书上把这一系统叫做：,R/M,体系。,限制与修饰是由两种酶引起的，一种是甲基转移酶，一种是核酸内切酶。,核酸有四个碱基，碱基排列有,44,个排列顺序，内切酶具有识别位点，他的限制性体现在可以识别这些位点，并进行切割，这样外源的,DNA,即使进入生物细胞，也可以被降解，这就是限制,;,修饰是由甲基化酶来完成的。在生物内部有甲基化酶，他们可以催化甲基从给体分子,S,酰苷甲硫氨酸转移给可识别的序列（内切酶），使之甲基化，这样内切酶无法识别甲基化的序列，就不能进行切割，从而保全了自身的,DNA,。,限制与修饰存在两方面的作用：一是保护自身的,DNA,不受限制，即不被切割；二是破坏外源,DNA,使之迅速降解。,如果没有限制修饰，,DNA,、基因到处都是，,顺利进入任何生物,改变遗传物质，发生变异。,2.,限制性内切酶的种类：,有三种不同类型：,型、,型、,型,型、,型在同一蛋白分子中兼有内切和甲基化活性并且其依赖,ATP,，,作用时吸收能量。,型：其内切酶活性和甲基化活性是分开的，只负责限制，因此叫限制性内切酶。修饰由独立的甲基酶完成。而且核酸内切作用具有序列的特异性，可识别回文序列AGCT-,，便于操作，广泛应用。,特点：,识别,特定的核苷酸序列,，其长度为,4-6,个碱基，甚至,8,个，少数酶识别更长的序列。特定的序列：又叫识别序列或识别位点。这些序列的一个共同特点是具有双重螺旋对称的结构形式，可以进行,180,度的旋转，呈回文结构。,限制性内切酶在识别序列后，对双链,DNA,进行切割，双链锻裂后，形成特定的酶切末端，叫“粘性末端”。粘性末端有三种形式：,5”,突出粘端：,EcoR,I,切点,5-G AATTC-3,3-CTTAA G-5,3”,突出粘端,：,Pst,I,切割位点,5-CTGCA G-3,3-G ACGTC-5,平端：,Sma,I,切割位点,5-CCC GGG-3,3-GGG CCC-5,二、限制性片断末端的连接作用,:,DNA,片断经限制性内切酶切割后，可自然的重新连接起来，或环化起来；,不同,DNA,片断通过互不的粘性末端之间的碱基配对而彼此相连接，称之为分子间连接。,同一,DNA,片断通过互不的粘性末端的碱基配对连接成环状形分子，称为分子内连接。,对重新连接的,DNA,片断经加热处理后，会重新线性化；,如果对连接或环化的分子用连接酶处理，形成的,DNA,分子就是永久性的。,限制性内切酶识别的靶序列同,DNA,的来源无关，也就是说不带有种的特异性，对各种,DNA,都普遍适用。无论那种生物的,DNA,经同一种酶作用切割后，形成的片断都能连接再一起，来实现,DNA,重组。,三、限制性内切酶的命名,:,1973,年，,Smith,和,Nathans,提出了一个较系统的命名原则：,Hin,d,III,H,aemphilus,in,fluenzae,嗜血流杆菌,D,菌株,第三个酶,Eco,R,I,Escherichia coli,大肠杆菌,R,菌株,第一个酶,四、影响酶活性的因素：,1,、靶,DNA,的纯度：内切酶的消化底物的速率很大程度上取决于使用的,DNA,样品本身的纯度。通常我们从生物样品中提取出的,DNA,容液中，含有许多物质，如蛋白质，多糖，酚、氯仿，酒精、乙二胺四乙酸（,EDTA,）,SDS,（十二烷基磺酸纳），高浓度的盐离子。这些都是酶活性的钝化剂。酚的影响最大，他可以使蛋白质变性，使酶失活。,消除办法：,尽量保证,DNA,纯度达到最大。酚抽提去蛋白；醇抽提（氯仿、异戊醇的抽提）去酚，去多糖；乙醇抽提去多元醇；沉淀（蛋白也沉，但,DNA,和蛋白能看的出来）；干燥去乙醇。,增加酶的用量，平均每,ug,底物,DNA,的用量可达,10,个单位或更多。但有一个问题：商品化的酶均加入,50,的甘油作为保护剂，在,20,度保藏不会结冻。如果加入酶量过大，甘油浓度过高，会抑制酶活性。,扩大酶切反映的,(,体积,),体系,使潜在的抑制因素被相应的稀释。,延长酶反映时间。可切,24,小时。,2,、,DNA,的甲基化程度：,核酸内切酶是原核生物限制修饰的组成部分，因此，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会强烈的影响酶的活性，造成,DNA,只能被局部消化。为了避免这种问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株来制备质粒,DNA,。,3,、酶切温度：,DNA,消化反应的温度是影响核酸内切酶活性的另一个重要的因素。,不同内切酶具有不同的最适反应温度，大多数酶的反映温度在,37,，消化时温度低于或高于最适温度，都会影响酶的活性，比如温度低切割时之产生切口，而不能切断,DNA,。,4.DNA,的分子结构：,DNA,分子的结构有很多种，以质粒,DNA,为例，他有三种存在方式，超螺旋、环状带切刻、线性。,往往切割超螺旋时用的酶量要比消化线性,DNA,的量高出许多倍，甚至,20,倍。,5,、内切酶对不同部位的切割位点，其切割效率有着明显的差别。这主要是由于切割位点的侧翼序列存在着差异的结果（通常切割效率的差异不会超过,10,倍）。,6,、内切酶的缓冲液：不同的酶使用不同的类型,Buffer,盐：,Mgcl,Nacl,Kcl,提供离子环境。酶的活性需要,2,价阳离子，“,Mg”,是最普遍的酶激活剂。,Tris-Hcl,:,缓冲液，他可以创造出,pH,是,7.4,的缓冲环境，保护酶分子，维持体系,pH,恒定。,巯基乙醇或二硫苏糖醇（,DTT,）,:,巯基试剂对于保护某些核酸限制性内切酶的结构稳定性起着很大作用，防止其失活变性。有效防止二硫键形成。,BSA,：牛血清白蛋白，酶的稳定性。,7.,非适宜环境包括：,非适宜环境包括：高浓度的内切酶（酶专一性变化，产生无度切割，一个位点本来不能切割，但切割了，又叫,Star,活性变化），高浓度的甘油，低离子强度，,Mg,被,Mn,取代，高,pH,。,8,、酶切时间：通常酶切时间,1,2,小时，但大多数酶的活性可维持很长时间，我们可以酶切过夜。,五、双酶切：,没有不同的,buffer:A/B/H/M/K.,注意选择两个酶通用的缓冲液,Ligases,S,ection two,DNA,连接酶：,DNA,被限制性内切酶消化后，单凭粘性末端是不能彼此牢固的连接在一起的需要进行连接处理，这样我们用到了,DNA,连接酶。,1.,概念：能够催化在,2,条,DNA,链之间形成磷酸二脂键的酶。条件是需要一条链的,3,末端具有一个游离的羟基（,OH,）,在另一条链的,5,端具有一个磷酸基团（,P,），另外由于形成二脂键是一种吸能反映所以反应中要有,ATP,（动物）和,NAD,（原核生物，氧化型）作为能源。,2.,特性：,DNA,连接酶不能连接两条单链,DNA,分子或环化的单链,DNA,分子，被连接的必须是双螺旋,DNA,的一部分。连接酶的来源有两种，一种是大肠杆菌染色体编码的,DNA,连接酶；另一种是大肠杆菌,T4,噬菌编码的叫,T4,连接酶，这种酶容易制备，直接从感染,T4,大肠杆菌的菌体中分离纯化，而且他可以连接两条平末端的,DNA,片断,DNA,连接酶只能连接,DNA,双螺旋骨架上的切刻，而不能连接封闭缺口。,反应温度：连接酶的最适反映温度是,37,，但我们不能采用这个温度,？,比如由内切酶,EcoRI,产生的粘性末端是,TTAA-,，末端搭连后，作用力是由,4,个,A-T,碱基对维持，,37,度下，他们的作用并不牢靠。但温度低末端连接慢。,我们在实验室操作中往往采用,4,15,比较合适，这个温度是介于酶的作用速率和末端结合速率之间，一般认为,4,连接反应进行较慢。连接反应可以是,4,连接,24,小时，或,15,过夜（注意参照说明书）。,DNA,连接酶用法与用量：,平末端,DNA,分子的连接最适反应的酶量为,1,2,个单位，,粘末端的连接，酶量为,0.1,个单位较好。,polymerase,S,ection three,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,I,Klenow,大片段,T4 DNA,聚合酶,反转录酶,Taq,酶,共同点：以一条,DNA,（,RNA,）为模板，通过聚合作用能够把脱氧核糖核酸连续的加到引物链的,3,OH,末端。,一、,DNA,聚合酶,I,大肠杆菌的,DNA,聚合酶,I,是一条约,1000,个,aa,的多肽链形成的单亚基蛋白，分子量,109x10,3,Da.,1.,三种活性：,聚合活性：将,4,种脱氧核糖核苷酸聚合为新的,DNA,链。,5-3,外切酶活性,:,3-5,外切酶活性：防止错配。,2.DNA,聚合酶,I,催化合成,DNA,链的条件：,四种核苷酸，,游离的,OH,模板链,3.,作用：,DNA,杂交的探针制备：依靠,DNA,聚合酶缺口平移。由于,DNA,聚合酶,I,具有,5,3,外切酶活性，切下后，聚合酶活性表现出来，又加上一个新的碱基可使切刻由,5,3,的方向移动，加上的,dNTP,用,P,标记，这样换上的新链上就有了放射性标记。,二、,klenow,片断：,用蛋白酶处理大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,产生两个片断，一个片断带有,53,外切酶活性；一个片断失去,53,外切酶活性，而保留下两种活性，该片断的分子量为,76 x 10,3,dal,这个片段就是,Klenow,大片段。,作用：可对,3,隐藏性末端进行修补，尤其是被内切酶消化后标记,DNA,片断的末端；,cDNA,合成中催化第二条链的合成（,DNA,聚合酶,I,也可，但安全性差，可能会将原链切割。）,NH,2,cooH,323,Polymerase,exonuclease,5,3,Thank You!,