发育生物学发育生物学研究技术.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/3,#,发育生物学研究技术,发育生物学发育生物学研究技术课件,第1页,1/48,惯用发育生物学研究技术介绍,显微镜技术,(,成像,imaging);,组织切片技术,(,经典解剖形态学,morphology);,生化分子生物学,;,原位杂交技术,(,in situ,hybridization);,显微注射,;,汇报基因技术,;,细胞标识技术,;,发育生物学发育生物学研究技术课件,第2页,2/48,显微镜技术,目标：观察胚胎个体,分类：,光学,(optical),显微镜,:,体视显微镜,:,组织分离用,荧光显微镜,：,发育生物学发育生物学研究技术课件,第3页,3/48,显微镜技术,激光共聚焦显微镜,(laser confocal),：,荧光标识，对胚胎或细胞中特定蛋白质或,mRNA,分布进行定性或定量研究；,图像采集效果很好,；细胞或组织三维重塑,(reconstructing),发育生物学发育生物学研究技术课件,第4页,4/48,组织切片技术,目标：观察胚胎内部组织学结构,分类：,石蜡组织切片：,石蜡包埋，切片机切片,冷冻切片：,低温包埋剂包埋，低温切片机切片，对样品中,核酸保留很好，但切片质量差。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第5页,5/48,分子生物学技术,目标：检测目标基因或蛋白质在某一发育时期或特定组织中表示,分类：,Polymerase chain reaction(PCR):,DNA amplification,Real-time quantitative PCR:,RNA,定量,RT-PCR/Northern blotting:,mRNA,expression,Western blotting:,protein,expression,免疫共沉淀,(Co-IP):,protein-protein interaction,发育生物学发育生物学研究技术课件,第6页,6/48,Northern Blotting Analysis,发育生物学发育生物学研究技术课件第7页,7/48,Southern Blotting Analysis,发育生物学发育生物学研究技术课件,第8页,8/48,Real-time PCR,仪,发育生物学发育生物学研究技术课件,第9页,9/48,原位杂交技术,目标：检测某一特定基因,mRNA,在某胚胎和组织中分布情况,分类：,放射性标识探针：放射自显影,非放射性标识探针：,地高辛,(DIG)-,免疫组化,荧光素,-,荧光免疫组化,(FISH),发育生物学发育生物学研究技术课件,第10页,10/48,原位探测基因表示,Gene expressing guiding development,When and where particular genes are active,Intact embryos or sections of embryos,In situ hybrid:probes-radioactive isotope,fluorescence tag or an enzyme,Dectection:autoradiography,fluorescence microscope,enzyme-substrate reaction,发育生物学发育生物学研究技术课件,第11页,11/48,原位探测基因表示,发育生物学发育生物学研究技术课件,第12页,12/48,原位探测基因表示,Distribution of mRNA for the growth factor Vg-1 in the amphibian egg.,In situ hybridization with a radioactive probe.(yellow signals),发育生物学发育生物学研究技术课件,第13页,13/48,原位探测基因表示,发育生物学发育生物学研究技术课件,第14页,14/48,利用原位杂交技术研究基因表示时空谱,mRNA,检测,发育生物学发育生物学研究技术课件,第15页,15/48,FISH,探测基因表示,发育生物学发育生物学研究技术课件,第16页,16/48,报道基因,(reporter gene),技术,目标：,用于开启子,/,增强子分析研究。采取一些产物易于检测基因,(,报道基因,),与待研究表示调控序列串联，经过转基因技术导入胚胎体内，分析报道基因产物表示来研究目标片断转录调整活性。,惯用报道基因分类：,绿色荧光蛋白,(GFP):,分布用荧光显微镜观察,lac,Z,基因,:,编码,-,半乳糖苷酶,用特异底物显色研究其产物分布,荧光素酶,(luciferase):,惯用体外基因表示活性分析，近年开始体内研究,发育生物学发育生物学研究技术课件,第17页,17/48,开启子活性检测法,表示载体构建：,发育生物学发育生物学研究技术课件,第18页,18/48,利用大分子间相互作用克隆新基因,判定可与蛋白质结合,DNA,序列,分离靶蛋白质，（可采取,gel-shift assay),克隆靶蛋白表示基因。,利用,DNA,与蛋白质间相互作用,发育生物学发育生物学研究技术课件,第19页,19/48,分离时空特异性表示基因方法,利用蛋白质之间相互作用,酵母双杂交法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第20页,20/48,显微注射及细胞标识技术,目标：,将外源,DNA,、,RNA,或标识物等导入早期胚胎细胞中，如利用细胞标识技术对胚胎早期卵裂球分化命运图谱研究。在小鼠和果蝇中惯用于转基因分析。,细胞标识物分类：,早期：,活体染料如尼罗蓝或中性红，不能标识胚胎内部组织,现在：细胞外,-,亲脂性荧光染料如,DiI/Dio,，不适于组织切片,细胞内,-,荧光标识葡聚糖和,HRP,，需显微注射，经过荧光显微镜或组织化学方法进行定位。,示踪基因：,GFP,和,LacZ,基因,发育生物学发育生物学研究技术课件,第21页,21/48,染料细胞标识,发育生物学发育生物学研究技术课件,第22页,22/48,荧光细胞标识,发育生物学发育生物学研究技术课件,第23页,23/48,细胞移植,发育生物学发育生物学研究技术课件,第24页,24/48,DNA/,蛋白芯片,目标：,高通量筛选不一样胚胎细胞或组织中基因,/,蛋白表示图谱，取得不一样时期或组织差异表示基因或蛋白。,DNA chip,Protein chipmicroRNA chip,分类：,发育生物学发育生物学研究技术课件,第25页,25/48,发育生物学发育生物学研究技术课件,第26页,26/48,应用,DNA microarrays,研究基因表示,High output screening genes expressed differently in different tissues or at different stages in development,发育生物学发育生物学研究技术课件,第27页,27/48,基因组时代：人类基因组计划,控制发育基因判定及其表示和功效检测方法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第28页,28/48,后基因组时代功效基因组时代,空间结构？,胞内分布及靶位？,影响器官？,基因类型？,底物？,影响路径？,发育生物学发育生物学研究技术课件,第29页,29/48,发育遗传学技术,发育生物学基本任务之一：,研究基因在胚胎发育中作用,正向遗传学技术：,大规模随机诱变，产生发育异常突变个体，然后再寻找突变基因。,1.,大规模诱变筛选,;,2.,插入诱变筛选,;,3.,突变基因克隆,;,从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因,发育生物学发育生物学研究技术课件,第30页,30/48,从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因,自然群体中突变体；,化学诱变剂处理，如亚硝基乙脲乙亚硝基脲,(N-nitroso-N-ethylurea ethylnitrosourea,ENU),；,外源,DNA,插入法，如,DNA,注射、病毒感染、转座子利用等；,X,射线或,r,射线照射,取得突变体方法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第31页,31/48,自发突变,(spontaneous mutation),Recessive mutation(,纯合体状态,)/Dominant,(,杂合体状态,),/semi-dominant,发育生物学发育生物学研究技术课件,第32页,32/48,自发突变,(spontaneouse mutation),semi-dominant mutation(,半显性突变,),发育生物学发育生物学研究技术课件,第33页,33/48,斑马鱼上,ENU,化学突变研究成就,(1996),从自然或人工突变体中分离判定控制发育基因,化学诱变法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第34页,34/48,大规模诱变筛选,经过射线或化学诱变剂处理父本个体，在其生殖系细胞中产生随机突变，然后与,wild-type,母本个体杂交，,F1,个体中可能携带有基因突变。,F1,与野生型，,F2(50%,杂合突变体,),群体内杂交，,F3(25%),可出现,纯合突变,个体，发育异常,发育生物学发育生物学研究技术课件,第35页,35/48,DNA,插入诱变法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第36页,36/48,反转录病毒插入引发突变判定,DNA,插入诱变法,发育生物学发育生物学研究技术课件,第37页,37/48,大规模诱变筛选,突变后,表型,改变：,致死性,功效丧失,：最常见。突变后蛋白质比野生型活性差；某一蛋白质完全失活突变为无效突变,(null mutation),功效取得,：如一些受体突变后活化,发育生物学发育生物学研究技术课件,第38页,38/48,插入诱变筛选,利用,转座子,(transposon),或病毒载体做诱变剂。果蝇中为,P-,因子，能够随即插入基因组中，并能够在基因组中移动，包含特殊序列和转座酶，后代生殖细胞中，转座酶就会诱导,P-,因子在基因中随即转座造成基因突变。发育生物学发育生物学研究技术课件,第39页,39/48,突变基因克隆,突变体取得后，克隆引发该突变基因,插入突变：,利用,P-,因子序列作为探针，从突变体文库中筛选出含,P-,因子克隆，从而确定其插入点及被阻断基因。,化学诱变或射线突变：定位克隆,(positional cloning),依据目标基因在染色体上位置进行基因分离。经过分析突变位点与已知分子标识连锁关系来确定突变基因染色体位置。惯用分子标识包含单核苷酸多态性,(SNPs),。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第40页,40/48,Positional cloning:,1,),确定突变基因染色体定位,2),获取该片断基因组序列数据库,3),生物信息学确定该片段可能含有基因，结合其可能功效和该突变体表型，确定候选基因,4),试验验证：功效异常，野生型,rescue,RNAi,发育生物学发育生物学研究技术课件,第41页,41/48,发育遗传学技术,反向遗传学技术：,经过功效丧失,(loss of function),或功效取得,(gain of function),试验，研究胚胎个体所产生表型而分析目标基因功效。,基因修饰,1.,基因敲除,;,2.,条件基因敲除,;,3.,转基因,;,发育生物学发育生物学研究技术课件,第42页,42/48,Constructing knockout mice,取得携带有特定基因突变个体技术，研究基因在发育中功效主要方法。,1),构建用于基因重组突变基因结构,2),重组基因导入胚胎干细胞,(ES),3),注射,ES,入胚胎中以取得杂合性小鼠,4),小鼠杂交取得纯合体小鼠并进行表型分析。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第43页,43/48,Conditional knockout,仅使靶基因在特定组织或发育时期失活。,Cre-,lox,系统,1)Cre,编码一个重组酶，可识别并结合位点并切除位于两个,LoxP,位点之间序列。,2),两个品系：靶基因两侧都加入,LoxP,位点,;,转入由组织特异性开启子控制,cre,基因,3),小鼠杂交，,cre,基因会在特异性组织中表示，切除靶基因，使之失活。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第44页,44/48,Transgenic technique,1),将外源基因注射到受精卵细胞核中，缺点是无法控制外源基因插入情况，只能经过后代检验,DNA,。,2),将外源基因转化到,ES,中，同,gene knockout,3),小鼠杂交。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第45页,45/48,发育遗传学技术,反向遗传学技术：,经过抑制性因子抑制目标基因功效,1.RNA,干扰,;,2.,吗啉代寡聚核苷酸,(MO):,利用反义寡聚核苷酸抑制特定,mRNA(5-UTR),翻译而阻断目标基因功效方法。主要应用在斑马鱼和爪蟾研究中，但现在也用于,miRNA,研究中。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第46页,46/48,RNAi,技术,1),双链,RNA,抑制含其同源序列基因表示，抑制基因表示新方法,2),线虫中：直接导入,dsRNA;,脊椎动物中,siRNA(21-23 nt),发育生物学发育生物学研究技术课件,第47页,47/48,发育遗传学技术,反向遗传学技术：,其它伎俩：,1.,显性抑制,(dominant negative):,经过过量表示显性抑制型蛋白,(,是经过某种修饰或加工，能够抑制野生型蛋白功效缺点型蛋白,),以阻断内源蛋白活性，研究其功效方法。如将一些信号传导受体膜内区域缺失等。,2.,基因捕捉,(gene trap),与增强子捕捉,(enhancer trap):,是一个报道基因转基因技术，用于取得在一些组织中特异性表示基因。如报道基因转入体内，如附近有内源性增强子，就可开启报道基因开启子激活。,发育生物学发育生物学研究技术课件,第48页,48/48,