月季的花药培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题,2,月季的花药培养,一、被子植物花粉粒的形成,花粉粒,(N),花粉壁细胞,(2N),花药,花丝,花粉橫切,花粉囊,小孢子母细胞,4,个小孢子,(,小孢子四分体时期,),1,个小孢子,(,单核居中期,),1,个小孢子,(,单核靠边期,),花粉管细胞核,生殖细胞核,花粉母细胞,2N,(,小孢子母细胞,),减数分裂,4,个小孢子,N,(,四分体时期,),4,个小孢子,N,单核期居中期,单核期靠边期,有丝分裂,4,个花粉管细胞核,4,个生殖,细胞核,有丝分裂,8,个精子,双核期,花粉壁细胞,两个精子和一个营养核的基因型相同。,花粉母细胞,2N,(,小孢子母细胞,),减数分裂,4,个小孢子,N,(,四分体时期,),4,个小孢子,N,单核期居中期,单核期靠边期,有丝分裂,4,个花粉管细胞核,4,个生殖,细胞核,有丝分裂,8,个精子,双核期,双核花粉粒：,成熟的花粉粒中，只含花粉管细胞核和生殖细胞核。,（精子在花粉管中形成）,花丝,花药：囊状结构，内有很多花粉粒,花粉是花粉母细胞,（即小孢子母细胞）,经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。,雄蕊：,花粉的发育要经历：四分体时期、单核期、双核期,练习：,写出花粉的发育过程的发育过程（学生板书）,假如一种生物体细胞有条染色体那么它的小孢子母细胞小孢子、花粉管细胞核、生殖细胞核各有多少条染色体？如果小孢子母细胞的基因型为,A,B,（两对基因位于两对同源染色体上）那么小孢子、花粉管细胞核和生殖细胞核的基因型是什么？,小孢子母细胞个小孢子单核居中期单核靠边期花粉粒,无论哪一种，来源于同一个小孢子的花粉管和生殖核的基因一定相同。,、，,AB,或,A,或,B,或。,形成原因：主要取决于培养基中的激素的种类及其浓度的比例,二、产生花粉植株的两种途径,合子胚：,由合子,(,受精卵,),发育成的胚,(,含胚芽、胚轴、根根等,),花粉胚：,由单倍体性细胞产生的类似合子胚的结构。,体细胞胚：,在组织培养过程中，某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，发育过程亦与合子胚类似，被称为,体细胞胚,(,胚状体,),。,三、影响花药培养的因素,1,、材料的选择,不同植物的诱导成功率很不相同，就同一种植物来说亲本的生理状况对诱导成功率也有直接影响。,花期早期,时的花药比后期的,更容易,产生花粉植物。,选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素。,因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体。,花粉发育的过程中，只有某一个时期对离体刺激敏感。,一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养的成功率最高。即：,最适合花药培养的小孢子发育时期为单核靠边期,。,选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；,选择单核期之后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难，且难以挑选到单核期的花药。,某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用,焙花青,-,铬矾法,，,这种方法能将,花粉细胞核染成蓝黑色。,最常用的方法有,醋酸洋红。,1,、方法,2,、培养基组成,P58,四、操作流程,(,一,),材料的选取,通过镜检确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。,1000mL MS,培养基 添加,2,4-D 0.4mg KT 0.2mg,IAA 4mg,调,pH,至,5.8,亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种的密度等对诱导成功都有一定的影响。,3,、其他因素,醋酸洋红法染色机理,2,、醋酸洋红法,染色操作醋酸洋红为,碱性染色剂,，而花粉细胞内的染色体,易被,碱性染料,着色染成,红色,。,将花药放在载玻片上，加一滴质量分数,1,的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片在显微镜下检查。,3,、焙花青,-,铬钒法,花药应该在,卡诺氏固定液中,固定,20min,，然后取出放在载玻片上，,加焙花青,-,铬钒溶液染色，,盖上盖玻片后在显微镜下检查。,1,、酒精处理,(,二,),材料的消毒,无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分。,花蕾用体积分数,为,70%,的酒精,浸泡,30,秒，立即取出。,无菌水清洗。,用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,2,、氯化汞处理,放入质量分数为,0.1%,的氯化汞溶液中,24,分钟,(,也可质量分数为,1%,的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液,),无菌水冲洗,3-5,次,为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？,花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药，给材料的消毒带来困难。,接种花药,培养,分化培养基培养,鉴定和筛选,常常会出现染色体倍性的变化,？,每个培养瓶接种,（,710,）,个花药,？,花药长出愈伤组织还要转移,到哪？,主要原因是营养核和生殖核融合造成的,否则接种后，容易从受伤部位产生,二倍体的愈伤组织。,与,花丝相连,的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。,(,三,),接种和培养,消毒后的花蕾要在,无菌条件,下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。,剥离花药时,不要损伤花药,要彻底除去花丝,通常每瓶接种花药,7-10,个，,25,左右,，,不需要光照,。幼小植株形成后才需要光照。,20-30,天培养后,发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体。,将,愈伤组织,及时转移到,分化培养基,上，以便进一步分化出再生植株。,如果花药开裂释放出,胚状体,，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快,将幼小植株分开,，分别移植到,新的培养基,上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现,染色体倍性,的变化。（主要原因是,营养核和生殖核融合,造成的）,故需对培养出来的植株作进一步的鉴定和筛选。,项目,组织培养,花药培养,基本理论,植物细胞的全能性,基本过程,外植体,脱分化,再分化,幼苗,影响因素,选材、营养、激素、,pH,、温度、光照等,材料选取,一般选择未开花植株茎上部新萌发的侧枝,通常选择完全未开放的花蕾,外植体类型,体细胞,生殖细胞,光照状况,每日用日光灯照,12h,开始不需要光照，细小植株形成后不需要,流程,制备,MS,培养基外植体消毒接种培养移栽栽培,选材消毒接种培养筛选移栽栽培,结果,正常植株,单倍体植株,可育性,可育,高度不育，秋水仙处理后可育,课题成果评价,选材是否恰当,选材是否成功是花药培养成功的关键。应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。,无菌技术是否过关,如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,接种是否成功,如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,2,、基因型为,AaBb,的水稻（条染色体）的花药通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下培养成试管苗。,（）愈伤组织是花粉细胞分裂形成的不规则的细胞团，愈伤组织必须从培养基中获得（）（,),和小分子有机物等营养物质。,（）要促进花粉细胞的分裂分化，培养基中应有（）（）两种激素。,愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根，由芽发育成叶茎。这一过程必须给予光照，其原因是（）利用光能制造有机物促进试管苗生长发育。,（）试管苗的细胞核中有（）条脱氧核苷酸链。试管苗的基因型有：,水,无机盐,生长素,细胞分裂素,叶,24,AB,Ab,aB,ab,3,（,9,分）草莓生产上传统的繁殖方式易将所感染的病毒传播给后代，导致产量降低。品质变差。运用微型繁殖技术可以培育出无病毒幼苗。草 莓微型繁殖的基本过程如下：,外植体 愈伤组织 芽、根 植株,（,1,）微型繁殖培育无病毒草莓苗时，一般选取,_,作为外植体，其依据是,_,_,。,（,2,）在过程中，常用的,MS,培养基主要成分包括大量元素、微量元素和,_,，在配制好的培养基中，常常需要添加,_,，有利于外植体启动细胞分裂形成愈伤组织。接种后,25d,，若发现外植体边缘局部污染，原因可能是,_,。,（,3,）过程中，愈伤组织在诱导生根的培养基中未形成根，但分化出了芽，其原因可能是,_,茎尖、根尖,茎尖、根尖不含病毒,有机物,植物激素,外植体消毒不彻底,培养基中生长素类物质和细胞分裂素类物质用量的比值偏低,项目,杂交育种,诱变育种,多倍体育种,单倍体育种,处理,杂交,用,射线、化学药品处理,用,秋水仙素处理种子或幼苗,花药离体培养,原理,基因重组，把两亲本优良性状组合在同一后代中,用,人工方法诱发基因突变，产生新性状和新品种,抑制细胞分裂中纺锤体的形成，使染色体数加倍后不形成两个细胞,诱导配子直接发育成植株，再用秋水仙素加倍成纯合体,优缺点,方法简便，但耗时长，需经多年才能获得纯合体,加速育种进程，大幅度改变某些性状，但有利个体不多,器官较大，营养物质含量高，但发育延迟，结实率低,缩短育种年限，但方法复杂，成活率低,举例,水稻杂交,高产量青霉素菌株,三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦,月季花药培养,人工种子,人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有,胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体,，,并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。,目前研制的人工种子，是由,胚状体、,作为保护性外壳的,人工种皮,和提供发育所需营养的,人工胚乳,三部分组成的。,能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。,人工种子的优点,:,首先，它,解决,了有些,作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。,第二，人工种子可以,工业化生产,，提高农业的自动化程度。,第三，,人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分,，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。,第四，,用人工种子播种可以节约粮食,。,例如，一个,12 L,的发酵罐在,20 d,内生产的胡萝卜胚状体，可以制成,1 000,万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。,（三）接种和培养,2,、氯化汞,处理,放入,质量分数为,0.1%,的氯化汞,溶液中,24,分钟,(,也可质量分数,为,1%,的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液,),无菌水冲洗,35,次,用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，,通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,在无菌条件下除去萼片和花瓣用镊子取出花药,要彻底去除花丝，,因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成,立即将花药接种于培养基上，通常每瓶,接种花药,7-10,个,。,1,、剥取花药,勿损伤花药，以免诱导出非花粉愈伤组织,2,、接种,注意：,培养条件：温度控制在,25,左右，不需要光照。,幼小植株形成后才需要光照。,3,、培养,培养：一般经过,20-30,天培养后，会发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体,长出愈伤组织则将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株,注意：如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，,必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，,分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化（主要原因是,营养核和生殖核融合,造成的）,4,、鉴定和筛选,1,、材料的选择,2,、培养基的组成,(MS,培养基,+,不同比例的激素,),3,、亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响,三、影响花药培养的因素,影响花药培养的因素,1,、材料的选择：,不同种类植物的诱导成功率不同。,同一种植物，亲本植株的生理状况对诱导成功率有直接影响。,合适的花粉发育时期,：花期早期时的花药最佳。,选择最合适的花粉发育时期,不选择单核期之前花药原因：花药质地幼嫩，容易破碎；,不选择单核期之后花药原因：花瓣开始松动，给材料消毒带来困难困难；,挑选单核期花药方法：应当选择完全未开放的花蕾，菌少，易消毒。,2,、培养基的组成,花药培养所采用的培养基各成分中植物生长调节剂的水平和配比起决定作用。,诱导愈伤组织或胚状体产生的培养基：广泛使用,2,，,4-D,、,IAA,和,KT,；,诱导分化的培养基常除去,2,，,4-D,而以,IBA,或,BA,等代之。,3,、其他因素：,材料的低温处理、接种密度、培养的环境条件等对诱导的成功率都有一定的影响。,实验操作,一、材料的选取,二、材料的消毒,三、接种和培养,（一）,材料的选取,1,、选择花药一般通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。,2,、确定花粉发育时期最常用方法：醋酸洋红法；焙花青铬矾法。,实验操作,鉴定花粉：,最常用的方法是醋酸洋红法：,花药（载玻片上）,1%,的醋酸洋红,1,滴用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成红色）,某些植物的花粉细胞核不易着色，需要采用焙花青,铬钒法：,花药（在卡诺氏固定液中处理,20min,）取出，置于载玻片上焙花青铬钒溶液染色盖上盖玻片镜检（花粉粒的细胞核被染成蓝黑色）,注：,花粉细胞核内有染色体，染色体主要由,DNA,和蛋白质组成，醋酸洋红为碱性染色剂，染色体容易被染色。通过染色，可以确定细胞核为单核期还是双核期，是单核居中期还是单核靠边期。一般单核靠边期的花药培养成功率最高。,（二）材料的消毒,1,、花蕾用,体积分数为,70%,的酒精,浸泡,30,秒,2,、无菌水清洗,3,、无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分,4,、放入,质量分数为,0.1%,的氯化汞,溶液中,2,4,分钟（也可,质量分数为,1%,的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液,）,5,、无菌水冲洗,3,5,次,用于培养花药，实际上多数未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态，所以只要将整个花蕾或幼穗消毒即可。,花蕾,（,70,酒精,）,大约,30s,（,无菌水,）,清洗,（,无菌吸水纸,）,吸干水分,（,0.1,氯化汞溶液）,2,4min,（,无菌水,）,冲洗,（三）接种和培养,灭菌后花蕾，要在,无菌条件,下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量,不损伤花药,（,否则接种后，容易从受伤部位产生二倍体的愈伤组织,），同时还要彻底,去除花丝,，,因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成,。,通常每瓶,接种花药,7-10,个,，温度控制在,25,左右，,不需要光照,。幼小植株形成后才,需要光照。,一般经过,20-30,天培养后，会发现花药开裂，长出,愈伤组织或释放出胚状体,。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。,如果花药开裂释放出,胚状体,，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。,在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化,（四）结果分析与评价,选材是否恰当：选材时实验成功的关键。要能通过镜检找到适宜发育期的花粉。,无菌技术是否过关：如果出现了污染现象，说明某些技术操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。,接种是否成功：如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。,植物组织培养技术与花药培养技术的异同点,项目,相同点,不同点,植物组织培养技术,离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导出根，然后进行移栽。,外植体为,体细胞，染色体数无需加倍。,花药培养技术,取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，而且为纯种。,实例一,关于被子植物花粉发育的说法，不正确的是（）,A,、,花粉粒是在花药中的花粉囊里形成的,B,、,被子植物精子的形成是直接减数分裂的结果,C,、,被子植物的花粉的发育要经历四分体时期、单核期、双核期等阶段,D,、,花粉粒在发育过程中，核先位于细胞一侧，再移到细胞中央,注：花粉母细胞经减数分裂形成,4,个单核花粉粒，每个花粉粒的细胞核进行一次有丝分裂形成,1,个花粉管细胞核和,1,个生殖细胞核，每个生殖细胞核再进行一次有丝分裂生成,2,个精子。,BD,课后习题：,1,、,F2,代紫色甜玉米的基因型组成可能为,Aasusu,或,Aasusu,。,如果运用常规育种方法，将,F2,代中的紫色甜玉米与白色甜玉米（,aasusu,）,进行测交，可以选择出基因型为,AAsusu,纯种紫色甜玉米。但这种方法比较繁琐，耗时较长，需要至少三年的选种和育种时间。如果利用花药离体培养的技术，在,F1,代产生的花粉中就可能有,Asu,的配子组合，再将花粉植株进行秋水仙素处理，使染色体加倍，就可以直接得到紫色甜玉米的纯合体（,AAsusu,）。,这种方法可以大大缩短育种周期。,2,、植物组织培养技术与花药培养技术的相同之处是：培养基配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。两者不同之处在于：花药培养的选材非常重要，需事先摸索时期适宜的花蕾，花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基，对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药培养的难度大为增加。,比较杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种,项目,杂交育种,诱变育种,多倍体育种,单倍体育种,处理,杂交,用,射线、化学药品处理,用,秋水仙素处理种子或幼苗,花药离体培养,原理,基因重组，把两亲本优良性状组合在同一后代中,用,人工方法诱发基因突变，产生新性状和新品种,抑制细胞分裂中纺锤体的形成，使染色体数加倍后不形成两个细胞,诱导配子直接发育成植株，再用秋水仙素加倍成纯合体,优缺点,方法简便，但耗时长，需经多年才能获得纯合体,加速育种进程，大幅度改变某些性状，但有利个体不多,器官较大，营养物质含量高，但发育延迟，结实率低,缩短育种年限，但方法复杂，成活率低,举例,水稻杂交,高产量青霉素菌株,三倍体无子西瓜、八倍体小黑麦,月季花药培养,人工种子,人工种子是指通过植物组织培养技术获得具有,胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体,，,并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。,目前研制的人工种子，是由,胚状体、,作为保护性外壳的,人工种皮,和提供发育所需营养的,人工胚乳,三部分组成的。,能在一定的条件下萌发生长，形成完整植株。,人工种子的优点,:,首先，它,解决,了有些,作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。,第二，人工种子可以,工业化生产,，提高农业的自动化程度。,第三，,人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分,，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。,第四，,用人工种子播种可以节约粮食,。,例如，一个,12 L,的发酵罐在,20 d,内生产的胡萝卜胚状体，可以制成,1 000,万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。,练习：小麦高杆（,D,）对矮杆（,d,）为显性，抗锈病（,T,）对不抗锈病（,t,）为显性，现有高杆抗锈病和矮杆不抗病的两种纯合体，要获得矮杆抗锈病的良种，可用杂交育种和单倍体育种法，步骤如下：,高杆抗锈病,矮秆不抗锈病,P DDTT,ddtt,(,一,),F1,的基因型表现型,a,各种配子的种类,a,（二）,符合要求的单倍体的基因型,良种的基因型表现型,（三）,（,1,）请在上图横线上填写上基因型、表现型内容。,（,2,）图中（一）（二）（三）采用的处理方法分别是,、,、,。,（,3,）单倍体育种方法的主要优点是,。,答案：（,1,）,DdTt,，高秆抗锈病，,DT,，,Dt,dT,dt,ddTT,矮秆锈病（,2,）杂交育种、花药离体培养，秋水仙素处理（,3,）可以明显缩短育种年限，加速育种进程。,