医学研究生开题报告.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PVRL1,基因多态性与环境交互作用和非综合征型唇腭裂的关联性研究,导 师：,xxx,研究生：,xxx,2011/05/24,一、课题名称,二、研究目的及意义,三、立论依据和研究现状,四、实验方法,五、预期目标,六、已具备条件,七、可行性,八、研究主要阶段、进度和完成时间,九、经费预算,十、实验风险及前景分析,一、课题名称,PVRL1,基因,SNPs,与环境交互作用,和非综合征型唇腭裂的关联性研究,二、研究目的及意义,探讨,PVRL1,的,SNPs,在,NSCL/P,的可能作用,探讨,NSCL/P,与环境因素的因果关系,揭示基因,-,环境交互作用,研究目的：,为,NSCL/P,基因诊断提供依据,为,NSCL/P,家庭提供遗传咨询,为广东人群基因数据库积累资料,研究意义：,三、立论依据及研究现状,唇腭裂畸形是人类最常见的先天性发育缺陷之一，全世界发病率约为,12,。我国是世界上唇腭裂的高发国家之一，发病率约,1.82,。,非综合征型唇腭裂（,NSCL/P,MIM 119530,）是指不伴发其他系统、器官畸形的，不在某些综合征之列的唇裂、唇裂合并腭裂、及腭裂的总成，约占先天性唇腭裂,70%,。,目前的研究认为,NSCL/P,是一类多因素复杂疾病，其发生是,遗传,和,环境,多种因素相互作用的结果，其遗传易感性和基因,-,环境交互作用是病因学研究的热点。,一、环境因素,环境生物因素,：孕早期微生物感染是导致,NSCL/P,的重要危险因素之一。,Metneki J,等,2005,年在匈牙利的一项大规模以人群为基础的病例对照研究中表明，妇女在孕早期患普通感冒及流感显著增加了子代唇腭裂患病的危险性（,OR=2.3,和,2.8,）。,环境物理因素,：环境物理因素主要包括电磁辐射（,X-RAY,、微波、无线电波、电视、手机、电脑等），噪音等。,Blaasaas,KG,等,2002,年的研究发现，孕妇每周接触,50HZ,电磁辐射大于,24,小时时，唇裂的发病风险增加（,OR=1.78,）。,环境化学因素,：包括药物、环境污染、烟酒嗜好、孕期营养等。,Ericson,等,2001,年在对,1995-1998,年出生的,2557,例婴儿进行研究，发现母亲妊娠期间服用,NASID,导致唇腭裂的风险增加（,OR=2.51,）。,Chuangsuwanich,等,1998,年在泰国的流行病学调查发现,52.74%,的唇裂患者母亲有孕期服药史。,环境污染,：,Marco,Vinceti,等,2001,年在意大利北部铅污染地区进行了以人群为基础的病例对照研究，发现铅污染使唇腭裂发病风险增加（,OR=2.28,）。,烟酒嗜好,：,Bailey LJ,等在,1995,年的研究中证明孕早期吸烟，产生的,CO,降低了胎儿的,O,2,供应，从而促使唇腭裂的发生。,Hartsfield JK,等在,2001,年的研究中认为烟草的复合物可能影响遗传物质的合成及应用。,孕期营养,：,Ingrid PC,等,2004,年的研究中认为孕期增加植物蛋白、植物纤维、抗坏血酸等的摄入可降低唇腭裂发生。,张思雷等,2002,年在对地塞米松诱导大鼠腭裂形成的研究中认为增加,VitB6,促进体内氨基酸和脂肪代谢等多种生命代谢，有助于胚胎修复唇腭裂畸形，增强抵抗力，降低先天性畸形的易感性。,二、个体因素,Shaw GM,等,1999,年的研究中认为孕妇年龄、文化程度、剧烈妊娠反应及妊娠并发症与唇腭裂的发病相关；不同胎次唇腭裂的发生率有高度显著性差异；体重轻的新生儿唇腭裂患病率高。,Spilson,等,2001,年的研究中发现糖尿病孕妇生育唇腭裂患儿的危险性是非糖尿病孕妇的,1.3,倍。,三、遗传因素,早期的遗传因素研究由于受研究方法、实验手段不够丰富所限制，学者们多通过已被证实的单基因致病的包含有唇腭裂的综合征来反推,NSCL/P,的易感基因。,近年来，随着人类基因组计划,(HGP),的实施以及基因芯片技术的发展，对易感基因的研究及新易感基因的寻找更倾向于全基因组关联分析,(GWAS),，这是发现影响复杂性疾病发生的遗传特征的一种新策略。,另外，国内外现在多认为单纯性腭裂（,cleft palate only,CPO,）和唇裂伴或者不伴有腭裂（,cleft lip with or without cleft palate,CL/P,）有不同的遗传学背景。前者倾向于单一主要基因影响（,X,和,2,号染色体）；后者受多种基因影响（,1,、,2,、,4,、,6,、,9,、,11,、,14,、,16,、,19,号染色体均有相关基因或位点）,CLP,易感基因定位及相关文献研究,CPO,易感基因定位及相关文献研究,PVRL1,（,Poliovirus Receptor Like-1,）位于,Chr11 q23.2,区，编码细胞,-,细胞粘附受体，协同钙粘素调整上皮黏着连接形成的速度，并影响上皮细胞之间紧密连接的形成，对,上皮粘附的发生和维持,起重要作用。,PVRL1,基因,(,本课题研究基因,),目前有关脊髓灰质炎病毒受体相关基因,1,（,PVRL1,）多态性与人群,NSCL/P,的关系还不十分清楚，国内外不同研究机构对该基因研究结果报道不尽一致，甚至相互背离。这可能与基因存在种族和地区差异性、样本量、研究方法、评定原则相关。,较早的对,PVRL1,和,NSCL/P,的相关性研究是,2000,年美国学者,Suzuki,Kj,等在加勒比海的,Margarita,Island,对,CLPED1,（,MIM 225000,，,MIM 225060),患者研究中发现了,PVRL1,编码的,185,（,TGG,T-G,）,和,323(GGT,GGTT),位氨基酸突变，此后在北部委内瑞拉的,NSCL/P,患者中同样发现了,PVRL1,编码的,185(TGG,T-G),位氨基酸的突变；同时，他们的研究还证实了该无义突变导致,PVRL1,编码的肽链的长度缩短，进而可能影响,上皮粘附,的发生。,然而,Scapoli,L,等,2005,年在意大利人群中并,没有发现,W185X,的突变，但是他们发现了,R199Q,、,R210H,、,R212H,、,D424D,这些突变，正常人中这几个氨基酸均为保守序列。,Tseng,等,2006,年在台湾的,NSCL/P,患者和,PVRL1,的关联研究中得出的结论是,185,和,323,密码子，特别是,W185X,的突变，也是,并不参与,台湾人群的,NSCL/P,形成。,赵雄等,2009,年在对江浙地区汉族人群的,PVRL1,研究中，也,没有发现,W185X,突变或者其他可信的多态性位点，得出结论是,PVRL1,基因,exon3,可能不参与江浙人群,NSCL/P,发病,另外，,Avila,等,2006,年在挪威、菲律宾、南美人群中对,PVRL1,的研究中总共发现了,25,个与,NSCL/P,相关的突变位点。其中比较有意义的,S112T,和,T131A,均出现在,PVRL1 V,区的关键氨基酸附近，该区域之前被认为是介导细胞,-,细胞粘附和细胞,-,病毒粘附的区域；还有,G361V,出现在跨膜区，被认为可能影响,PVRL1,的结构。,Tongkobpetch,等,2008,年发现，泰国,CL/P,患者的,PVRL1,基因第,6,外显子的,1183GA,具有杂合性，会导致,395,（,V395M,）位的缬氨酸被甲硫氨酸取代。,然而舒申友等在,2010,年对,PVRL1,的病例对照研究中，,并没有发现,证据表明,S112T,、,T131A,、,G361V,和,V395M,参与了广东人群的,NSCL/P,形成。,Turhani,等在,2005,年欧洲人群的研究中发现,CLMPT1,基因的内含子,IVS7-10G/A,，外显子,Gly331Gly,Ala88Ala,Pro309Pro,的突变联合,PVRL1,基因的,Glu441-Gly442,插入,Glu,突变同时发生的话，可能是,NSCL/P,的遗传因素。,综上所述，国内外的研究机构对,PVRL1,基因的多态性与,NSCL/P,的发病关联性研究中存在比较大的分歧，这样的结果一方面可以理解为人群的,遗传背景不同,，另一方面也与一些,研究中的设计,（例如样本量，纳入研究范围的样本）不同有关系。这样的原因导致统计强度不够，,可能存在未被发现的多态性位点或者有意义的已知突变位点被误筛,。,四、实验方法,基于以上理论，采取可信公认的研究方法，在,PVRL1,基因,90kbp,的,bases,中筛查可疑的多态性位点，进而对阳性位点附近序列进行测序，而后进行,病例,-,对照研究,和,家系分析,两种分析方法揭示,PVRL1,基因单个,SNP,位点或单倍型与,NSCL/P,的关系，最后揭示,PVRL1,基因的多态性与环境因素（流行病学调查）的交互作用与唇腭裂发病的关联，是本研究的技术路线。,路线一,1,、病例筛选：选取,2008-2010,年在我中心住院手术的,NSCL/P,患者核心家庭,200,个（共,600,个个体），另外,150,例,NSCL/P,患者（单纯患者，无父母参与）和,350,例健康志愿者对照组。提取外周静脉血,10ml,备用。,2,、提取所有研究对象共,1100,份基因组,DNA,。,3,、从人类基因组单体型计划,(,HapMap,Project),数据库中已有的,891,个已知,PVRL1,基因的,SNPs,中使用软件,SNPbrowser4.0(ABI),挑选出,26,个,Tag SNPs,（每个可以代表,4000bp,碱基段），使用,引物单碱基延伸,+,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（,MALDI-TOF,）,的方法行,SNP,分型并,LD,检验行单体型分析。,单体型分析图,A six-nucleotide insertion-deletion polymorphism in,the CASP8 promoter is associated with susceptibility,to multiple cancers.NATURE GENETICS VOLUME 39 NUMBER 5 MAY 2007,4,、运用,病例对照,-,研究,检验方法揭示单个,SNP,位点，或者多个,SNP,位点（即单体型块）与,NSCL/P,之间的相关性。,5,、发现阳性位点之后，在阳性位点附近安排,24,轮,DNA,测序,（,Sanger,法，每个反应扩增,500,个,bp,左右，若,4,轮反应则总共检测,2000,个,bp,左右片段，共,700,个样本），,力求发现新的未被报道的突变位点。,6,、同样使用,MALDI-TOF,的方法行,200,个核心家系父母（共,400个个体）,SNP,分型。而后结合前述所在家庭患儿的,SNP,分型进行,传递不平衡检验,，力求发现阳性（与,NSCL/P,有关联）的过传递位点。,附：统计分析将使用软件：,HAPLOVIER3.32,软件行等位基因的,HWE,检验、等位基因和单倍型的关联分析等。,PLINK,软件行基因型和等位基因的关联分析。,UNPHRASED,软件行病例,-,对照研究。,路线二,1,、对研究对象（,200,个核心家庭）父母进行电话调查，具体调查项目包括儿童基本情况、父母基本情况、母亲妊娠早期情况、母亲既往史等。,2,、进行资料统一编码，建立数据库并录入数据。,3,、分析暴露因素与,NSCL/P,发生的关系。技术路线图,五、预期目标,1,、揭示,PVRL1,基因在广东人群中的单体型。并与,NSCL/P,建立关联。,2,、发现新的,SNP,位点或者突变的,DNA,片段。并与,NSCL/P,建立关联。,3,、揭示广东人群唇腭裂的环境危险因素。,4,、探讨环境因素和遗传因素在,NSCL/P,发病中的交互作用。,六、已具备条件,1,、本研究前期标本（血样）收集已经完成。,2,、,2010,年在本中心的一个广东省自然基金课题中已经对,PVRL1,基因作了初步研究，但是样本量只选取了,71,患者和,100,个对照，样本量不够降低了统计检验的强度。,3,、本中心对,NSCL/P,易感基因的研究已经积累充分经验可提供宝贵的理论和实践指导。,七、可行性,1,、本研究样本量较大，结果真实性和可靠性较有保证。,2,、,MALDI-TOF,检测方法被众多,SCI,杂志推荐为,SNP,检测方法。尽管,TAQMAN,探针法的特异性更高，但是相对于质谱法其成本贵，通量也不如质谱。,八、工作主要阶段、进度和完成时间,1,、实验所需血样基因组,DNA,已大部分提取完毕。,2,、,TAG SNPs,已选取完毕。,3,、已与上海邃志生物技术公司联系，洽谈委托试验。,4,、,2011,。,3,月开始实验，预期于,2011,。,10,月完成全部实验和结果分析，并撰写论文投稿。,九、经费预算,1,、基因组,DNA,提取试剂盒6,盒（天根生物技术公司）约合,RMB 10,000,。,2,、,SNPs,质谱分析部分,1100,个样本量约,RMB 100,000,。,3,、预期发现,14,个阳性位点，若发现一个阳性位点，于位点周围安排,4,轮测序，每个反应,RMB 3035,，则总计,RMB 72,000,。,总计,RMB 180,000,。,十、实验风险和前景分析,1,、若是无法发现阳性,SNP,位点，将导致后续测序等工作无法进一步进行。若是没有发现关联的,SNP,位点，至少在研究中借鉴的是目前较为主流的全基因组关联分析（,GWAS,）方法，阴性的结果也具有可信性。可能说明该基因的多态性不参与广东人群的,NSCL/P,发病。,2,、实验所用血样已经至少经过,2,次冻融，基因组,DNA,降解程度或较高，可能会影响后续实验。,3,、人群选择问题，病例组是广东、福建、广西、海南人群，而对照组几乎来自全国各地，可能产生人群混杂机会较大。,感谢聆听！,