基因组学-第3章-基因组结构的维持.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因组结构维持与改变,基因组的相对稳定(维持)是物种生存的需要：依靠复制（模板依赖性）与修复,基因组改变是进化的基础,基因组改变的类型：,1)突变(mutation)小范围序列改变,单个或几个核苷酸的替换、插入、缺失,来源于DNA复制错误或诱变破环。,2)重组(recombination)大范围序列重建,同源重组、位点特异性重组、转座,来源于染色体内或染色体间序列的交换。,基因组改变与修复,主要内容,基因组复制,突变与DNA,修复,重组与转座,DNA复制的三种可能途径,半保留复制的实验证明,Meselson-Stahl实验（1）,在含有,15,NH,4,Cl的培养基中培养大肠杆菌,将细菌转移到正常培养基（含,14,NH,4,Cl）,分别于细菌分裂一次和两次后取样，密度梯度离心,半保留复制的实验证明,Meselson-Stahl实验（2）,细胞中必然存在着一种解决拓扑学问题的方法,拓扑异构酶,解旋酶解决了拓扑问题,催化断裂-再连接反应的酶。,在DNA分子一条或两条链上形成切口，通过切口解开螺旋。,在复制过程中拓扑异构酶解旋DNA双螺旋,以半保留模式为主体的不同复制形式,替代复制,滚环复制,复制过程,DNA的复制发生在细胞周期的S期,起始,延伸,终止,复制起始,双向复制,基因组中形成两个复制叉（复制眼），分别以一条链为模板，双向复制,每条链复制中，DNA合成方向相同：5,到3,两条链复制行进的方向相反,基因组结构与复制起点,复制起始存在着固定的位点，复制起点(origin of replication),细菌：环形基因组只有单一的复制起点,真核生物：线性基因组存在多个复制起点,酵母：332个,人类：20000个,大肠杆菌复制起点,复制起点,oriC,，长约245bp,2个重复基序,1）9核苷酸5拷贝 DnaA蛋白结合位点 结合30个DnaA蛋白,2）13核苷酸3拷贝 富含AT,几个解旋相关蛋白,DnaA,HU,Dna C,DnaB 解旋酶,酵母复制起点,自主复制序列ARS，不足200bp,含四个具相似序列的亚结构域：,A+B1 起始识别序列约40bp，为起始识别复合物（ORC)结合部位,B3与大肠杆菌复制起点相似 结合ARS结合因子（ABF1)，从而使B2的双螺旋结构解开,高等生物复制起点,目前仍难以确认,将某些复制起始区域转入复制缺陷性质粒后不能重建复制能力,存在酵母ORC蛋白同源基因,复制延伸,在复制起点形成复制叉,母代双链中一条连续复制，称前导链；一条不连续，称滞后链（半不连续）,DNA聚合酶,引物,参与DNA复制的DNA聚合酶,细菌5个，其中DNA聚合酶III是复制酶,真核生物9个，其中DNA 聚合酶,是复制酶,前导链连续合成，后滞链非连续合成,合成方向：5,到3,滞后链合成中，最初形成一些短的片段，称冈崎片段,细菌冈崎片段长约1000-2000个核苷酸，真核生物的冈崎片段则短得多，少于200个核苷酸,模板依赖性的DNA聚合酶需要引物来启动单链上的DNA合成,非连续合成中的引物与引发酶,RNA引物：DNA聚合酶不能作用于无引物的单链模板，而RNA聚合酶可以,细菌中引发酶（primase）合成4-15bp的引物,引发酶不是转录酶,细菌和真核生物在DNA合成引发中的差异,细菌只需引发酶合成RNA引物,真核生物由引发酶和DNA聚合酶,形成复合物合成RNA引物和其后的约20个DNA核苷酸,大肠杆菌复制需要多种蛋白的协作,拓扑异构酶、解旋酶(DnaB)：解旋,DNA聚合酶III：复制,引发酶；提供引物,单链结合蛋白（SSB)：稳定打开的双链,连接酶：连接冈崎片段,其它蛋白,大肠杆菌复制中解旋酶的作用,DnaB是大肠杆菌中复制相关的主要解旋酶,，是一种5-3解旋酶,它可以沿后滞链移动，同时使碱基对断裂,另外两种3-5解旋酶：PriA、Rep,拓扑异构酶解除解旋所产生的扭转张力,大肠杆菌复制中单链结合蛋白的作用,单链结合蛋白（SSB），复制中打开的单链容易重新结合及降解，SSB是一种缺乏酶活性的蛋白，会结合到多聚核苷酸上防止两条链的重新结合及降解。,大肠杆菌SSB是由4个相同的亚基组成。,当复制复合物开始复制时，SSB必须与单链分离，这一作用由复制介导蛋白（replication mediator protein,RMP）来完成。,引发小体（primosome）与复制体（replisome）,引发小体,复制起始中，解旋酶结合到起点以后形成引发前复合物，然后引发酶结合，形成引发小体。,引物合成后，由,DNA,聚合酶,III,二聚体来延伸。,DNA,聚合酶,III,二聚体与引物小体结合称为复制体。,大肠杆菌复制中完成滞后链合成的方式,复制酶DNA聚合酶III不具备5,-3,外切酶活性，到达下一个冈崎片段末端的RNA引物时停止,DNA聚合酶I和RNaseH共同作用去除RNA引物，代之以DNA,真核生物中后滞链合成的方式,RNaseH模型：RNaseH去除引物至其最后一个核苷酸，侧翼内切核酸酶(FEN1)去除最后一个核苷酸和部分DNA,侧翼模型：DNA聚合酶,和解旋酶使引物与模板间碱基对断开，并被推成分支，再有FEN1切除分支,大肠杆菌基因组复制终止,不允许发生的情况,存在终止序列：Tus蛋白识别位点,Tus蛋白的不同结合方向控制了复制叉是否能够通过,真核生物线性DNA分子末端的维持：所复制的DNA分子可能变短的问题,线性DNA分子的末端变短的原因,真核生物DNA末端(端粒)由端粒酶合成,人类染色体末端的延伸由端粒酶完成,染色体末端延伸过程的完成,端粒长度和衰老癌症有关,Cell：庄小威揭示端粒功能新机制,第二节 突变与DNA修复,复制中的突变,复制中的自发错误,尽管DNA聚合酶存在校正能力，但是但突变仍不可避免,大肠杆菌的复制错误率 1/10,7,，经修复后基因组复制总错误率降至1/10,11-10,点突变,转换 嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶,颠换 嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤,插入或缺失,出现在编码区 可能导致移码,其它区域 可能导致多态性（复制滑移）,物理和化学诱变导致突变,化学：,1）碱基类似物替代标准碱基参与复制,5-溴尿嘧啶和2-氨基嘌呤,2）脱氨,3）烷化,4）嵌入 溴化乙锭,物理：,1）紫外辐射 形成嘧啶二聚体,2）电离辐射,3）加热,突变可能不影响基因组,存在很多不影响基因组功能的突变,沉默突变：,1）突变在基因间非调控区域或基因间非编码区域，对整体基因组功能无影响的突变。可发生在人类基因组的98.5%。,2）编码区的突变不影响编码蛋白的氨基酸序列，同义突变,点突变对基因编码区的四种影响,同义：突变后，由于密码子兼并性，而不影响所编码的氨基酸,非同义：引起氨基酸的错误编码,无义：引起过早终止,通读：引起无法终止,编码区的插入或缺失突变可能导致不同的影响,插入或缺失的核苷酸是3的倍数，仅影响个别氨基酸，因此影响可能较小,非3的倍数，将导致移码,非编码区突变可能影响基因组的功能,基因表达调控区域的突变：,顺式作用元件，如核心启动子、关键调节序列,内含子剪接位点的突变：,如5,剪接点,DNA聚合酶确保DNA复制精确性的机制,核苷酸选择,聚合前选择正确的核苷酸,校对,3,到5,外切酶活性，聚合后切除错配的核苷酸,四类DNA修复系统,直接修复,切除修复,针对诱变损伤,错配修复,针对复制错误,重组修复,人类DNA修复基因,切除修复,主要修复系统，人类参与蛋白最多的修复系统,碱基切除 单核苷酸切除 15个基因参与,核苷酸切除 一段核苷酸切除,28个基因参与,碱基切除修复,DNA糖基化酶,切除碱基，产生无碱基（AP）位点,AP内切核酸酶,产生单核苷酸切口,DNA聚合酶,填补碱基,DNA连接酶,连接断裂,核苷酸切除与UvrAB修复系统,错配修复中子代DNA的识别,针对复制错误，所以发生与子代DNA分子,一个问题：如何区分子代DNA分子?,大肠杆菌中子代新生分子尚未甲基化，从而可以区分,甲基化位点：,5,-GATC-3,A甲基化,5,-CCA/TGG-3,C甲基化,错配修复与Mut修复系统,双链断裂修复,比单链损伤严重,可能由电离辐射和化学诱变产生,也可能由重组产生,也称为重组修复,SOS应答,回避是生存的一种方式,修复难以进行时,绕过主要损伤位点，允许某些复制错误保留，继续复制,第三节 重组与转座,重组与进化,重组，各种包括多聚核苷酸断裂和再连接的过程。,没有遗传重组就没有进化,重组使不利和有利的突变得以分离，使适者生存，因此是自然选择的遗传学基础。,重组的一般类型-同源重组（一般性重组）,位点特异性重组（同源区很短）,转座,同源重组（Homologous recombination）,同源重组，也叫一般性重组（general recombination）,发生在具有高度序列同源性的DNA片段之间。这些片段可处在不同染色体上，也可以是同一染色体的不同部分。,真核生物中，发生于减数分裂时期，负责减数分裂中的互换。,同源重组的Holliday模型,交换,连接,分支迁移,断裂,Holliday结构分离,重组是由于异源双链体DNA间发生断裂与重连,两条双链DNA分子间的重组关键是单链的交换,交换产生异源双链体DNA片段,当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉结构（Holliday结构）,分叉迁移使交叉点移动，封闭切口,两次（相互的）交换才能产生一个联合分子,联合分子可以通过切开相接的链来形成两条分开的双链体分子,Holliday结构与重组体的形成,重组体是否形成取决于参与交换的链在解离过程中是否被切开,切开，则水平分离，基因组不是重组体，但包含异源双链体DNA,不切开，则垂直分离，产生互相重组的基因组,Holliday模型的缺陷与Meselson-Radding修正模式,Holliday模型的缺陷：切口是如何出现在两条分子的同一位置的？,单分子切口,切口链侵入未打开的双螺旋，形成D-环,被取代链断开，形成另一个分子上的切口,修正：在两分子切口形成过程中引入交换的D环,大肠杆菌重组系统：1）RecBCD形成单链切口,RecBCD具有核酸内切酶活性和解旋酶活性,内切酶：于Chi位点切开单链,chi位点 5,-GCTGGTGG-3,解旋酶：使单链末端游离,大肠杆菌重组系统2),RecA,链交换,DNA聚合酶,填补间隙,RuvA,B,分叉迁移,RuvC,切除Holliday连接点,Holliday模型修正后无法解释基因转换,配子（AA)X配子（aa),合子（AAaa),单倍体孢子（A或a),正常情况：A/a=1/1,基因转换：A/a不=1/1,双链断裂模型,单分子双链断裂,外切酶使断裂扩大,一个3,端侵入未打开的双螺旋，形成D-环,另一个3,端链延伸,相互移动形成双交换，即形成两个Holliday结构,两个Holliday结构的解离可以解释基因转换,位点特异性重组（site-specific recombination）,同源重组是发生于两段高度序列同源的DNA区域间，但是这种广泛同源的区域并不是重组的必要条件，该过程也能由两个只具有很短相同序列的DNA分子引发。这称为位点特异性的重组。,DNA整合到大肠杆菌基因组中,DNA整合到大肠杆菌基因组中参与的酶,整合通过,att,位点，,基因组中的,attP,位点和大肠杆菌基因组中的,attB,位点，之间的特异性重组进行。,每个结合位点的中心有一个15bp的相同的核心序列：O序列。,细菌基因组中O序列旁侧的可变序列为B和B；,基因组旁侧的可变序列为P和P。,核心序列突变会导致,att,位点失活，旁侧序列突变只会降低重组效率。,O序列,位点特异性重组的三种类型,DNA插入：一个DNA片段在特定位点插入。,DNA片段缺失。,DNA片段倒位。,重组结果是造成DNA的插入、缺失还是倒位，由DNA分子或参与重组其它分子上的重组识别位点的结构决定。,重组酶通过识别重组位点来发生重组,每个重组位点由一对对称排列重组酶识别位点（recombinase recognition sequences）构成。识别序列中间所包围的是一个短的不对称序列，称为交换区（crossover region），DNA的断裂和重新连接就发生在这里。,单个DNA分子上的两个位点可能反向重复（inverted repeat），也可能同向重复（direct repeat)排列。,同一个DNA分子上两反向位点间重组发生倒位，而两同向位点间发生缺失。,两个不同分子间发生插入。,重组酶家族与功能,丝氨酸重组酶家族,酪氨酸重组酶家族,功能：切割和连接,转座（transposition）,转座，是一个DNA片段从基因组中的一个位置移动到另一个位置的过程。这些可移动的片段称作转座元件或转座子（transposon）。,保守型转座：剪切-粘贴,复制型转座：增加拷贝数,1)经过RNA中间体（逆转座），逆转座子,2)不需要RNA中间体，DNA转座子,