基因工程原理与技术-3.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 质粒载体,质粒载体大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，共同具有,复制必需区,、,选择标记基因,、,限制性酶切位点,(,克隆位点,)。,一、质粒的一般生物学特性,质粒是染色体外能自我复制的小型DNA分子，大小为1200kb以上。存在于,细菌,(最广泛),、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中。,1、质粒的分子特性,双链环形DNA,(,绝大多数,)、双链线形DNA、RNA(酵母的杀伤质粒)。,提取的质粒有三种构型：,闭合环形DNA,(超螺旋构型)，,开环形DNA,，,线形DNA,。,2、质粒的复制类型,严紧型,：,严格受宿主控制，13拷贝,松弛型,：,不严格受宿主控制，10200拷贝,质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与R1质粒正好相反。,大多数质粒载体的复制起始区都来源于,pMB1质粒,，正常情况下在宿主细胞中可维持至少15个拷贝。,氯霉素、或链霉素等存在可使质粒的拷贝数达到几千个。,二、理想质粒载体必须具备的条件,1、,天然质粒用作载体的局限性,分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适。,天然质 粒,相对分子质量,拷贝数,单一酶切位点,选择性标记,pSC101,5.810,6,（9.09kb）,13,Eco,R I,tet,r,ColE1,4.210,6,20,Eco,R I,大肠杆菌素,RSF2124,7.410,6,10,Eco,R I(,Bam,H I),amp,r,9.09kb,2、理想质粒载体的必备条件,具有较小的分子量和较高的拷贝数,；,具有若干限制性酶的单一酶切位点(,多克隆位点,，multiple cloning sites，,MCS,)；,多克隆位点,(,多接头,，,polylinker,，或限制性酶切位点库）是指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。,具有两种以上的选择标记基因；,缺失,mob,基因或,nic,位点；,插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达。,三、质粒载体的构建,1、载体构建的基本原则,根据基因操作的工作需要；,符合理想载体的必备条件；,选择适合的亲本质粒提供载体元件,；,尽量简化构建程序。,2、pBR322的构建,3个亲本质粒,(,见图,),1,、Tn3 转座到pMB1上形成pMB3；,2,、pMB3的,Eco,RI*片段重排形成了更小的pMB8；,3,、pSC101的,Eco,RI*片段与pMB8的,Eco,RI*片段连接形成pMB9；,4,、Tn3 转座到pMB9上形成pBR312；,5,、pBR312的,Eco,RI*片段重排形成pBR313；,6,、pBR313的,Eco,RII片段重排形成pBR320；,7,、pBR313的,Pst,I片段重排形成pBR318；,8,、pBR320的,Pst,I和,Hinc,II双酶切片段与pBR318的,Pst,I和,Hap,I双酶连接形成pBR322。,4,R1drd19,(Tn3),pMB1,pMB3,pMB8,pSC101,pMB9,pBR312,pBR313,pBR320,1,1,2,3,3,4,5,6,pSF2124,(Tn3),pBR318,7,pBR322,8,3、pBR322的改良,进一步降低载体的大小；如,pAT153,、,pXf3,等。,优点：,a、失去了pBR322的HaeII的两个片段，分子量更小，拷贝数高pBR322的1.53倍；,b、失去了nic位点，更安全。,pAT153,引入带单一,Eco,RI,的选择标记；如,pBR324,(9.1kb，具有大肠杆菌素E1基因和免疫imm基因)、,pBR325,(氯霉素抗性基因)。,引入,lac,Z选择标记基因；如pUC系列载体(,见下图,),引入MCS位点；如pUC系列载体(,见下图,)。,lacZ,基因,：大肠杆菌的乳糖操纵子的启动子和-半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸(-肽)的编码序列。,-互补,：是指载体表达的-肽与宿主菌中F因子的,lac,ZM15基因的突变产物结合(-肽与突变-半乳糖苷酶的C-端片段结合)形成具有酶活性的功能蛋白质的现象。,蓝白斑筛选筛选,)：是指利用外源基因插入载体上,lac,Z5端的多克隆位点而破坏-互补、不能催化平板培养基中5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)形成蓝色产物、致使形成白色的重组菌落而筛选出重组子的方法。,四、常用的质粒载体类型,1、克隆质粒载体,克隆质粒载体是指专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体。如：pBR322及其派生质粒载体、pUC系列载体、T载体。,pUC质粒载体较pBR322,有四个优点,T载体,Hph,I 的识别序列,T/A克隆,2、表达质粒载体,表达质粒载体,是指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。,表达载体,(根据受体细胞),原核细胞表达载体,真核细胞表达载体,表达载体,(根据表达蛋白的转运),分泌型表达载体,非分泌型表达载体,表达载体,(根据表达蛋白的组成),融合型表达载体,非融合型表达载体,pBV221,rrnB,大肠杆菌表达载体的特征,(与克隆载体相比)：,强启动子；如,Lac,、,Trp,、,Tac,、,P,L,、,P,R,、,T7启动子,。SD序列；,强终止子。如,rrnB,。,制备RNA探针的载体,两条链RNA 探针的制备程序,简化外源蛋白纯化的载体(标签载体),pBAD/His,常用的标签,：,多聚组氨酸残基,、,结合麦芽糖蛋白,、,谷胱甘肽-s-转移酶,。,亲和层析法纯化外源蛋白,。,Bgl,II site of the MCS.,pBAD/His的三种变体,(3种读码框),Myc,：myc抗体的抗原决定簇,标签为生物素羧化酶载体蛋白基因,链霉素亲和层析柱,3、多功能质粒载体,具有,克隆,、,表达,、,测序,、,体外转录,等多种功能，避免了重复操作。如,pGEM系列质粒载体：,4、穿梭质粒载体(,shuttle plasmid vector,),穿梭质粒载体,是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制的质粒载体。,如：,大肠杆菌-土壤农杆菌,穿梭质粒载体(植物转化载体)、,大肠杆菌-酿酒酵母,穿梭质粒载体(,见下图,)、,大肠杆菌-枯草芽孢杆菌,穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、,大肠杆菌-动物细胞,穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物细胞穿梭质粒载体。,第二节 噬菌体载体,一、噬菌体载体的生物学特性,1、噬菌体的生活周期,2、噬菌体的基因组结构和功能,cos位点,(cohesive-end site)：DNA环化时其粘性末端形成的双链区段.,左侧区：AJ，约20kb,右侧区：NR，约12kb,中间区：JN，约18kb,，,为非必须区段,cI 基因控制溶源过程，阻遏溶菌周期所有基因的表达,3、噬菌体的DNA复制,裂解周期的早期,：,型双向复制,，产生,环状DNA分子,；,裂解周期的晚期,：,型滚环复制,，产生,线性多聚体DNA分子,。,5,二、噬菌体载体的构建,1、构建噬菌体载体的基本原理,野生型噬菌体不适于用作载体,：DNA基因组大，具有常用限制性核酸内切酶的识别位点多个(如5个,Bam,HI位点、6个,Bgl,II位点、5个,Eco,RI位点、7个,Hin,dIII位点等)；噬菌体具有,包装限制,，外壳只能接纳一定长度(即相当于基因组大小的75105)的DNA分子，只能克隆2.5kb的外源DNA片段。,对野生型噬菌体的改造,：切除掉DNA的非必需区段；除去DNA必需区段中的限制酶识别位点，在非必需区引入合适的限性酶位点；,引入适当的选择性标记；在某些必需基因中引入无义突变使之成为安全载体。,2、构建,噬菌体载体的基本内容,除去多余的限制酶识别位点,利用大肠杆菌限制与修饰系统，采用体内遗传重组技术。例如，,将噬菌体在,Eco,RI限制-修饰的宿主和,Eco,RI限制-修饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了,Eco,RI酶切位点的噬菌体。然后将突变体同野生型噬菌体在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有12个,Eco,RI酶切位点的重组体噬菌体。,根据克隆位点数，可将噬菌体载体分为,插入型载体,(insertion vectors)和,取代型载体,(replacement vectors，,置换型载体,)。,插入型载体,：只具有,一个克隆位点,可供外源DNA插入的噬菌体载体。,克隆容量较小一般在10kb以内，用于cDNA及小片段DNA的克隆,。,根据噬菌斑的混浊和清亮来区分重组体,取代型载体：,具有成对的克隆位点以使两个位点之间的 DNA区段可以被外源DNA片段取代的噬菌体载体。,克隆容量较大,，20kb左右，常用来构建高等真核生物的基因组文库,。,切除掉DNA的非必需区段,按野生型DNA分子长度为 48kb计算，噬菌体的包装上限是 51kb，而必需DNA区段约28kb，因此，载体克隆外源DNA的,理论极限值是23kb,。,包装限制是对重组体的一种正选择,(,见下图,)。,引入适当的选择标记,在噬菌体载体的非必需区段插入,LacZ基因,，其中带有多克隆位点。,引入无义突变,在裂解周期的必需基因内引入无义突变，噬菌体便只能在具有无义突变抑制基因的大肠杆菌宿主中存活。如,Charon 4A是在晚期基因A、B中引入了琥珀突变,。,Bam,HI,三、常用的噬菌体载体,1、,Lac Z基因,失活的插入型载体,如：gt11、gt1823、Charon2、Charon16A等。,2、,免疫功能,(cI基因)失活的插入型载体,如：gt10、NM1149及Charon6、Charon7等。,3、,Charon系列,取代型载体,如：Charon3235、Charon40、Charon21A等。其MCS含有,Eco,RI、,Sac,I、,Sma,I、,Xba,I、,Sal,I、,Pst,I、,Hin,dIII、,Bam,HI,4、,EMBL系列,取代型载体,如：EMBL3、EMBL4、EMBL3A等。,5、,Spi,-,选择,取代型载体,野生型噬菌体不能在在P2噬菌体的溶源菌中生长，即为,Spi,+,表型,。当其缺失red、gam基因，就能在P2溶源菌中能生长并形成噬菌斑，便获得,Spi,-,表型,。,这类载体的中间填充片段上都具有red、gam基因，当中间填充片段被外源DNA取代后，重组体便能在P2溶源菌中生长并形成噬菌斑，而非重组体则不能在P2溶源菌中生长，这种筛选重组体的方法称为,Spi,-,选择,。,6、ZAP插入型载体,在ZAP中，含有一个pBluescript噬菌粒的DNA片段(,见下图,)，位于J基因和cI基因之间，两侧是,f1复制起始子和终止子,，在辅助噬菌体M13或f1存在下，能获得带外源DNA的噬菌粒，用于测序和限制图谱构建等(,其它,载体的缺陷,)。,第三节 单链DNA噬菌体载体,M13、f1、fd是一类丝状大肠杆菌噬菌体，都含有同源性很高的6.4kb单链环状的DNA分子。目前，以M13噬菌体构建出一系列单链DNA 噬菌体载体。,优点,：它们不存在包装限制问题，能包装6倍基因组长的DNA分子，克隆容量大。制备单链DNA分子，用于基因定点突变、基因测序、杂交探针制备等。容易地测定出外源DNA片段的插入方向。可从大肠杆菌中制备双链的复制型DNA，如同质粒一样，能在体外进行基因克隆操作。其两种形式的DNA分子都能够转染感受态的大肠杆菌，或产生噬菌斑，或形成侵染的菌落。,一、M13噬菌体的一般生物学特性,1、,M13噬菌体的基因组结构,基因VIII和基因III、基因II和基因IV之间的间隔区较长，其他基因间隔区只有数个核苷酸。,虽然基因II和基因IV之间的间隔区(507nt),包含有复制和转录的调控序列，但,外源DNA在此插入，并不影响噬菌体DNA的复制。,2、M13噬菌体感染、复制及包装,M13噬菌体的繁殖并不会导致宿主细胞发生溶菌，但会减慢其生长。,基因II,基因,二、M13噬菌体载体的构建,M13mp1是构建的第一个M13噬菌体载体，是在M13噬菌体的IG区段的,Bsu,I限制酶切位点上插入了大肠杆菌的lacZ序列，但仅具有基因工程中不常用的,Ava,II、,Bgl,II、,Pvu,I的单一酶切位点及,Pvu,II三个酶切位点。,M13mp2,是利用点突变把M13mp1的,-肽的第5个氨基酸密码子中的鸟嘌呤转换成腺嘌呤，从而引入了一个,Eco,RI限制酶切位点。,M13mp3,同样是在M13mp1的,-肽的第119密码子位置引入一个,Eco,RI限制酶切位点。,M13mp711、M13mp18和M13mp19等是在M13mp2的,Eco,RI位点引入人工合成的多克隆位点。,M13mp7的MCS呈对称排列,而其他的呈非对称排列,这样用两种酶消化会产生两种末端的DNA片段.,三、M13噬菌体载体的主要用途,DNA 测序；,基因定点突变；,探针制备。,四、,M13噬菌体载体的缺点,插入的外源DNA片段不稳定，片段越大，越容易发生缺失或重排。一般情况下其有效的最大克隆能力仅1.5kb。,理论上M13噬菌体载体克隆外源DNA片段有两种插入方向，但实际上外源DNA总是按一种主要的取向插入的。,五、噬菌粒载体,噬菌粒载体,是一类含有单链噬菌体(,M13,)复制起点的质粒载体。,噬菌粒载体的优点,：,分子量较小，约为3kb，可克隆10kb的外源DNA片段。,在宿主细胞内可按质粒DNA复制，形成的双链DNA既稳定又高产。当辅助噬菌体存在时，按M13噬菌体的滚环复制模型进行复制产生单链DNA分子。,具有多种功能。如基因,克隆、基因定点突变、DNA测序、体外转录等,在多克隆位点的两侧具有,T7噬菌体启动子,，可进行体外转录。,第四节 黏粒载体(cosmid vector,),黏粒载体,是一类含有噬菌体,cos序列,的质粒载体。又称柯斯质粒载体。,一、黏粒载体的特点,具有噬菌体的体外包装、,高效感染,等特性。当然黏粒载体本身不能在体外被包装，只有在克隆了合适长度的外源DNA片段，才能被包装成噬菌体颗粒，这是对重组子的正选择。,具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性。,黏粒载体的分子量较小，,克隆容量大,。按噬菌体包装限制(3851kb)，黏粒载体的,最大克隆容量为48kb,(如,pHS262,)，,最低为14kb,(如,pJC720,)。,具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,二、黏粒载体的构建,黏粒载体都是在通用的克隆质粒载体的基础上，引入cos序列以及其它一些序列构建而成的。如pHC79来源于pBR322，pJB8来源于pAT153。,此外，引入两个cos位点，如c2XB，解决黏粒克隆存在的问题；在多克隆位点两侧引入一对T3、T7噬菌体启动子，制备RNA 探针，用于鉴别黏粒文库中的重叠克隆。如pWE15、pWE16。,构建与常用的大肠杆菌质粒载体没有同源性序列的黏粒载体。如pcos1EMBL，与colE1之间缺乏同源性。导入真核细胞病毒的复制起点及相关选择性标记，从而构建了大肠杆菌-真核细胞的穿梭载体。如pWE15、pWE16等。,三、黏粒克隆的基本程序、存在的问题及解决方案,黏粒克隆是指应用黏粒载体克隆大片段DNA的技术。,1、黏粒克隆的基本程序,2、黏粒克隆存在的问题及解决方案,在连接反应中，黏粒载体片段彼此首尾相连形成多聚体分子。,解决方案,：,一是,用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,二是,使用,Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案,(见下图),；,三是,使用,Bates-Swift黏粒克隆方案,(,双cos序列的黏粒载体,，,见下图,)。,在连接反应中酶切的基因组DNA片段(特别是较小的DNA 片段)往往会出现两个或数个片段随机再连接，串联地插入到载体上，其连接顺序并不符合基因组中排列顺序。因此，DNA序列分析结果往往会出现错误。,解决方案,是将局部消化产物通过凝胶电泳分级分离，获得长度为3145kbDNA片段。,Ish-Horowicz-Burke黏粒克隆方案,Partial,Sau,3A digestion,Phosphatase,Partial,Sau,3A digestion,phosphatase,BamHI SmaI,Bates-Swift黏粒克隆方案,四、常用黏粒载体及应用,常用的黏粒载体,：pJB8、c2XB、pHC79、pWE15、pWE16、pcos1EMBL、Charomid系列等。,黏粒载体主要用于真核生物的基因组文库构建。由于其克隆容量大，可以减少基因组文库的克隆数，提高筛选时阳性克隆的检出率，大大地减少了工作量。,黏粒载体在以下两种情况下特别有优势,：,在单个重组体中克隆和增殖完整的真核基因；,克隆与分析组成某一基因家族的真核DNA区段。,第五节 其它载体,一、人工染色体,1、酵母人工染色体(,YAC,),酵母自主复制序列,；,酵母着丝粒,；,四膜虫端粒,；,酵母选择性标记,(,Trp1,、,Ura3,、,Sup4,抑制宿主细胞ade2的琥珀突变,)。,克隆容量,：1002000kb,SUP4,114 kb,YAC的优点,：,克隆容量大，构建的基因组文库克隆数少，能保持基因组特定序列的完整性，有利于制作物理图谱。,YAC的缺点,：,用其克隆外源基因易出现嵌合体(4060的克隆是嵌合体，由于重组所致)；,某些克隆不稳定，有从插入序列丢失其内部区段的倾向(由于重组所致)；但可以通过将YAC文库转化到重组缺失的宿主来减少嵌合体形成和不稳定性的问题；,YAC克隆不容易与酵母自身染色体(15Mb)相分离。,2、细菌人工染色体(BAC),6.9 kb,来源于F质粒。,克隆容量,：,300kb,优点,：,拷贝数低，稳定，比YAC易分离,。,3、P1派生人工染色体(PAC),P1噬菌体载体,PAC载体F1 Replicon,克隆容量,：,100300kb,特点,：,单拷贝，克隆稳定,4、哺乳动物人工染色体(MAC),结构组成,：,哺乳动物细胞染色体的复制起始区、端粒、着丝粒。,克隆容量,：,1000kb以上,用途,：,研究保证有丝分裂、减数分裂精确进行所需要的DNA片段大小；,研究哺乳类细胞中染色体的功能；,利用 MAC的巨大包容性对大而复杂的基因进行克隆和功能分析；,用于基因治疗。,二、植物基因工程载体,植物转化载体,：质粒转化载体、病毒转化载体。,1、,质粒转化载体,Ti质粒(tumor-inducing plasmid),Ri质粒(root-inducing plasmid),2、病毒转化载体,双链DNA病毒转化载体,花椰菜花叶病毒(CaMV),克隆位点：基因,、基因、间隔区IR1(,见下图,)。,克隆容量：250bp左右,The map of the CaMV genome,单链DNA病毒转化载体(,双粒病毒,),双粒病毒,Begomoviruses,：两个单链环状DNA分子，感染双子叶植物，粉虱传播，如,番茄金花叶病毒,(TGMV),Mastreviruses,：1个单链环状DNA分子，感染单子叶植物，叶蝉传播，如,小麦矮化病毒,(WDV),WDV已发展为病毒转化载体，外源基因取代基因,、基因而不影响其复制。,TGMV也已发展为病毒转化载体，用外源基因NptII取代外壳蛋白基因，实现表达。,、RNA病毒转化载体,基本操作方法,：,a、病毒 RNA反转录成单链cDNA；,b、单链cDNA合成双链cDNA；,c、将双链cDNA克隆到质粒、Cosmid中；,d、然后将外源基因插入到克隆在质粒的病毒cDNA中；,e、通过体外转录获得病毒-外源基因的,嵌合RNA,去感染植物。,烟草花叶病毒(,TMV，见下图,),、马铃薯X病毒(,PVX，见下图,)已通过外源基因插入到运动蛋白基因与外壳蛋白基因之间或取代外壳蛋白基因在植物中表达。,Genome map and expression of TMV,Genome map and expression of PVX,三动物基因工程载体,动物基因工程载体主要是由动物病毒构建的一类载体。,动物病毒侵入动物细胞后，呈现类似于噬菌体的两类生长状态，即裂解感染和整合性感染。,1、SV40病毒载体,取代型载体,包括,早期转录区取代载体,和,晚期转录区取代载体,。由于这两个区对病毒感染循环是必需的，因此，必须通过共转化辅助病毒反式补偿这些功能。但最大只能插入2.5kb的外源DNA。,混合型载体,SV40混合型载体,是带有SV40复制起点或调控序列及T抗原基因的质粒载体。,T7,pcDNA3.1,5.4kb,2、反转录病毒载体,原病毒基因组,病毒基因组,PB：复制时引物结合位点；,：包装信号；gag：结构蛋白；pol：反转录酶和整合酶；env：病毒外壳蛋白；LTR：长末端重复序列，含有启动子、增强子及poly(A)信号等顺式作用序列。,反转录病毒载体的构建原理,：顺式作用序列是反转录病毒进行整合、复制所必需的，而反式作用序列不必自身具备，可由辅助病毒提供。在构建反转录病毒载体时，保留病毒基因组的顺式作用序列，用外源基因替代病毒的反式作用序列，取代的外源DNA片段可长达7kb。,用于获得稳定转化的细胞,。,3、杆状病毒载体,杆状病毒载体是以,苜蓿银纹夜蛾多角体病毒DNA,为基础构建的。,多角体蛋白对病毒感染和复制是非必需的，其表达水平高，在感染周期晚期可达细胞蛋白的一半以上。因此，可将外源基因插入或取代多角体蛋白基因而构建昆虫细胞高表达载体。,4、痘苗病毒载体,痘苗病毒基因组结构复杂，长约200kb的线性双链DNA，有一个28kb的复制非必需区。,痘苗病毒能在宿主的细胞质中独立地复制和转录，不会致瘤，表达产物常被修饰，而且易于培养，高度稳定，宿主范围广。因此，痘苗病毒载体常用来构建,痘苗病毒活疫苗,。主要是将外源基因插入到病毒的胸腺嘧啶核苷激酶基因(tk基因)克隆位点，用胸苷类似物5-溴脱氧尿苷进行负筛选。,用痘苗病毒载体表达的外源基因有：乙型肝炎表面抗原基因，流感病毒血凝素基因，狂犬病毒表面糖蛋白基因，以及单纯疱疹病毒、EB病毒、水泡性口炎病毒、伪狂犬病毒和疟原虫等有关抗原基因。,5、腺病毒载体,腺病毒为双链DNA病毒，病毒颗粒呈二十面体，其基因组(,见下图,)大小为35kb，在线性DNA两端为100150nt的反向末端重复序列(ITR)，ITR为病毒复制所必需的。在宿主细胞核内进行复制，以末端蛋白的丝氨酸残基起始复制。,腺病毒内通过宿主细胞的胞吞作用被有效吸收；其次腺病毒DNA不整合到宿主染色体上，不会引起插入突变；再之可转染分裂后的细胞，长期表达。因此，,腺病毒载体是一种良好的,基因治疗载体,。,构建腺病毒载体的基本原则是缺失E1、E2、E3基因序列，保留其12个酶切位点，供外源基因插入或取代。腺病毒载体的最大克隆容量约10kb。,早期转录单位：E1a、E1b、E2a、E2b、E3E4(E2b编码末端蛋白和复制酶),晚期转录单位：MLT(L1、L2、L3、L4、L5),包装位点：,其他基因：,VA、plX、IVa2,第六节 表达载体,一、表达载体构建的一般原则,1、,阅读框架与外源基因高效表达,表达载体一般都有三种变体，以适用于具不同阅读框架酶切位点的基因表达。,用人工接头可以调节阅读框架。,2、,启动子与外源基因高效表达,转录起始的速率是基因表达的主要的限速步骤。选择强启动子增强子是构建高效表达载体的首要问题。,原核细胞表达载体常用的可诱导强启动子：,Tac、Trc、Lac、Trp、P,L,、P,R,、phoA等。动物细胞表达载体常用的组成型启动子：SV40、腺病毒人巨细胞病毒和Rous肉瘤病毒的启动子及增强子。,3、,转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达,除去衰减子；,插入抗转录终止序列；,强转录终止序列；原核生物一般,用rrnB。,真核生物,poly(A)位点。,4、,有效的翻译起始与外源基因高效表达,原核生物表达载体：起始密码优先为AUG；在起始密码前具有SD序列；SD序列与起始密码之间的距离为,93bp；起始密码前两个核苷酸为AU，即AUAUG序列；起始密码后的序列为GCAU或AAAA序列；在翻译起始区应不形成明显的二级结构。,真核细胞表达载体：起始密码共有序列,5CC,A(G),CC,ATG,G,3,5、,终止密码与外源基因高效表达,原核生物表达载体：UAA，或几个终止密码串联。,6、,密码子选择与,外源基因高效表达,消除基因中的限制密码，以其他同义密码替代。,7、,外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达,构建融合表达载体，表达融合蛋白；构建分泌表达载体，表达分泌蛋白。,8、,减轻细胞的代谢负荷,特别是毒性蛋白。,使用诱导启动子,合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系。如pET载体(,见下图,)。,二、植物表达载体,1、启动子,组成型启动子,花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子,、,胭脂碱合成酶基因(Nos)启动子,、,章鱼碱合成酶基因(Ocs)启动子,(,见下图,)。,Nos启动子和Ocs启动子也具有一定的损伤诱导和激素诱导活性，六聚体基元反向重复序列为其必需的。Nos启动子还表现出一定的组织特异性，在老组织内通常比新生组织中强，在而且禾本科植物中几乎没有启动表达能力或表达能力很弱。,在双子叶植物中，35S启动子比Nos启动子的转录水平高30倍。,Nos启动子/Ocs启动子的结构,TATA盒,CAAT盒,TGACGT,AAGCACAT,ACGTCA,-,30,-,40bp处,-,60,-,80bp处,-,104,-,123bp处,六聚体基元的反向重复,TATA盒,CAAT盒,TGACGT反向重复序列,增强子,A区：-90+8bp,B区：-343-90bp,CaMV 35S启动子的结构,A区主要负责在胚根及根组织内表达，B区主要负责子叶、叶组织及维管组织内表达。,组织特异型启动子,马铃薯块茎蛋白基因的启动子、,小麦胚乳特异表达的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因启动子，番茄果实成熟特异性表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子、烟草TA29启动子、木质部特异表达的苯丙氨酸脂肪酶基因（pal）启动子。,组织特异性启动子除具有真核生物启动子的一般结构外，同时往往还有增强子和沉默子。,诱导型启动子,光诱导启动子,(核酮糖二磷酸羧化酶小亚基基因),、,热诱导启动子,(果蝇hsp70S基因),、,创伤诱导启动子,(蛋白酶抑制剂基因),等。诱导型启动子除具有真核生物启动子的一般结构外，还具有相应的,应答元件,.,2、选择标记和报告基因,必备条件,：a、不存在于正常植物细胞中；b、较小，可构成嵌合基因；c、能在转化体中高效表达；d、具有相应的有效选择剂，或容易检测，并能定量分析。,(1),选择标记,相应选择剂必须符合,：,a、能抑制未转化细胞的正常生长，但并不杀死细胞，即毒性低；b、对转化细胞生长和器官分化的影响不大。,新霉素磷酸转移酶基因,(Npt-II，来自Tn5),选择剂：,卡那霉素,、庆大霉素、G418等。,对茄科、十字花科植物的转化选择特别有效，对豆科植物、单子叶植物选择效果不佳。,双氢叶酸脱氢酶突变基因(DHFR，来自突变鼠),选择剂：氨甲蝶呤钠(毒性极大，能强烈抑制双氢叶酸脱氢酶的活力，影响转化频率，一般不使用),潮霉素磷酸转移酶基因,(HPT，来自细菌),选择剂：,潮霉素,(对多数植物有毒性，但在用卡那霉素不能进行有效筛选时，以它作为选择标记显得十分有用。对禾谷类作物它比Kan选择更有效),氯霉素乙酰转移酶基因(cat，来自Tn9),选择剂：,氯霉素,(作为选择标记并不理想，常作为报告基因),除草剂PPT乙酰转移酶基因,(bar基因，来自放线菌),选择剂：膦丝菌素(在禾谷类作物上比Kan选择更有效),(2)报告基因,报告基因,是指用于检测与其组装在一起的外源基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因。,冠瘿碱合成酶基因,章鱼碱合成酶基因(Ocs)、胭脂碱合成酶基因(Nos)等。,-葡萄糖苷酸酶基因,(GUS),-葡萄糖苷酸酶催化5-溴-4-氯-3-吲哚-葡糖苷酸酯(X-Gluc)形成兰色产物，使表达的细胞或组织染成蓝色。,大多数植物在营养生长阶段并不具GUS活性，但在果实、种皮、胚乳和胚中却 明显具有GUS活性。,荧光素酶基因或GFP基因,(3)选择标记基因和报告基因的选用策略,不同植物对选择剂的敏感性不同；,不同外植体对选择剂的敏感性不同；,植物是否有本底物存在。,