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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,OD(optical density，吸光度),OD260/OD280来判断分子纯度,当OD260/OD280 2.0，表示RNA含量较高,当OD260/OD280=1.82.0，表示DNA较纯,OD260/OD230 的比值来判断所得到的核酸中的盐和小分子杂质的残留程度,对于核酸纯制品，OD260/OD230应大于2；,OD260/OD2302说明去盐不充分,用于细胞转染的质粒大提浓度最好能达到300ng/L以上,碱基平均分子量,324.5,。,合成公司交给你的引物成品一般是会注明有几个,OD,，正常情况下,1,个,OD,相当于,33g,。,Tm值的简单计算,蛋白分子量估算,N(氨基酸数量)110 Da,增加,PCR,特异性,镁离子浓度,镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，引物退火，影响PCR产量和特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200M dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定,；,促进PCR的添加剂,退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法。为获得最好的结果需要模板的完全变性。PCR添加剂，包括,甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution，,可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。,RNA提取与验证,RNA完美提出来的话应该是三条带：28s，18s，5.8s；,28s和18s比较亮，而且28s是18s的2倍量，5.8s基本很模糊，可有可无；,28s是5.0kb，18s是1.9kb，5.8s 要小于200kb（人）,细胞培养瓶（板）生长面积容量与细胞数,24孔板长满了细胞大约有3X10,5,个细胞。如果一天后要长到70（2.1x10,5,），建议放1.2-1.4X10,5,个细胞。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件，不会达到24小时翻一倍的速度。,大约数目,96孔板 45X10,4,35mm培养皿 1X106,48 孔板 1.3X10,5,60mm培养皿 2.6X10,6,24孔板 2.5X10,5,100mm培养皿 7X10,6,12孔板 5X 10,5,150mm培养皿 1.8X10,7,6孔板 1.2X10,6,细胞瓶面积 容量 工作体积 细胞数目,12.5cm2 25ml 2ml 5X10,5,25cm2 50ml 5ml 1X10,6,35cm2 75ml 10ml 2X10,6,75 cm2 250ml 15ml 4X 10,6,150cm2 700ml 40ml 1.1X10,7,Kozak sequence,Kozak,规则，即第一个,ATG,侧翼序列的碱基分布所满足的统计规律若将第一个,ATG,中的碱基,A,，,T,，,G,分别标为,1,，,2,，,3,位，则,Kozak,规则可描述如下：,(1),第,4,位的偏好碱基为,G,；,(2)ATG,的,5,端约,15bp,范围的侧翼序列内不含碱基,T,；,(3),在,-3,，,-6,和,-9,位置，,G,是偏好碱基；,(4),除,-3,，,-6,和,-9,位，在整个侧翼序列区，,C,是偏好碱基。,需要指出的是，,Kozak,规则是基于已知数据的统计结果，并不绝对，而且对于不同的物种有所差别。,真核引物设计需在,AUG,前加上,GCCACC,加,Kozark sequence(GCCACC),是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的,AUG,环境，避免,ribosome,（核糖体）出现,leaky scan,蛋白标签,蛋白标签（,protein tag,）是指利用,DNA,体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。,TrxHIS,His6,是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的,C,末端或,N,末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析,(IMAC),，对重组蛋白进行分离纯化。使用,His-tag,有下面优点：,标签的分子量小，只有,0.84KD,，而,GST,和蛋白,A,分别为,26KD,和,30KD,，一般不影响目标蛋白的功能；,His,标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；,His,标签融合蛋白也被用于蛋白质,-,蛋白质、蛋白质,-DNA,相互作用研究；,His,标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。,可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；,可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。,Flag,标签蛋白,Flag,标签蛋白为编码,8,个氨基酸的亲水性多肽（,DYKDDDDK,），同时载体中构建的,Kozak,序列使得带有,FLAG,的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。,FLAG,作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：,FLAG,作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。,融合,FLAG,的目的蛋白，可以直接通过,FLAG,进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高,FLAG,作为标签蛋白，其可以被抗,FLAG,的抗体识别，这样就方便通过,Western Blot,、,ELISA,等方法对含有,FLAG,的融合蛋白进行检测、鉴定。,融合在,N,端的,FLAG,，其可以被肠激酶切除（,DDDK,），从而得到特异的目的蛋白。因此现,FLAG,标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。,HA,HA,标签蛋白，标签序列,YPYDVPDYA,，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，,9,个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小,容易构建成标签蛋白融合到,N,端或者,C,端。易于用,Anti-HA,抗体检测和,ELISA,检测。,c-Myc,C-Myc,标签蛋白，是一个含,11,个氨基酸的小标签，标签序列,Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,，这,11,个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。,C-Myc tag,已成功应用在,Western-blot,杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中,可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。,Avi Tag,AviTag,标签蛋白是一个,15,个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的,N,端和,C,端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。,Avi Tag,标签系统具有以下几大优点,:,无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的,Avi Tag,位点轻易且有效地被生物素化；,生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；,生物素,Avi Tag,只有,15,个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。,MBP,（麦芽糖结合蛋白）,MBP,（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为,40kDa,，由大肠杆菌,K12,的,malE,基因编码。,MBP,可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。,MBP,标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，,MBP,可以融合在蛋白的,N,端或,C,端。纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用,10mM,麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在,0.2%Triton X-100,或,0.25%Tween 20,存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为,pH7.0,到,8.5,，盐浓度可高达,1M,，但不能使用变性剂。如果要去除,MBP,融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用,MBP,抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。,GST(,谷胱甘肽巯基转移酶,),GST(,谷胱甘肽巯基转移酶,),标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为,26KD,。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。,GST,融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用,10mM,还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。,GST,标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下,GST,融合蛋白是完全或部分可溶的。纯化：该表达系统表达的,GST,标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶,(Glutathione sepharose),亲和树脂进行纯化。,GST,标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。,GST,在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。如果要去除,GST,融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。检测：可用,GST,抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。eGFP,增强型绿色荧光蛋白,激发波长,488nm,，发射波长,507nm,eYFP,增强型黄绿色荧光蛋白,激发波长,513nm,，发射波长,527nm,eCFP,增强型青色荧光蛋白,激发波长,433nm,或,453nm,，发射波长,475nm,或,501nm,优点,不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。,其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。,同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。,其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现,eGFP,表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。,SNAP-Tag,SNAP-Tag,是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相,(,如,SDS-PAGE gels),等。,SNAP-Tag,是从人的,O6-,甲基鸟嘌呤,-DNA,甲基转移（,O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase,）获得。无论体内还是体外，,SNAP-Tag,都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。,SNAP,所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使,SNAP,所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以,SNAP,标签反应是高特异的。检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内,SNAP-Tag,融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的,SNAP-tag,融合蛋白。,将纯化的或未纯化的,SNAP-Tag,融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。,Halo Tag,HaloTag,标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的,HaloTag,配基有效地共价结合。这个分子量为,33KDa,的单体蛋白能融合在重组蛋白的,N,端或,C,端，并在原核和真核系统中表达。,HaloTag,配基是小分子化学物，能够在体外或体内与,HaloTag,蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：,(1),一个通用的,HaloTag,反应联结子，结合,HaloTag,蛋白；,(2),一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得,HaloTag,蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。,SUMO,SUMO,标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（,Small ubiquitin-like modifier,），是泛素,(ubiquitin),类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，,SUMO,与泛素只有,18%,的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现,SUMO,可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。此外,SUMO,还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为,SUMO,蛋白水解酶（,GeneCopoeia,）能识别完整的,SUMO,标签蛋白序列，并能高效地把,SUMO,从融合蛋白上切割下来。切除,SUMO,后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以,SUMO,标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。,