第2章-基因工程制药-第1、2、3节.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 概 述,20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医药科学领域。,1982年第一个基因工程产品-人胰岛素在美国问世。,优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩大应用、改造不足。,生物技术的核心是,基因工程,，基因工程技术最成功的,成就,是用于生物治疗的,新型生物药物的研制,基因工程技术生产药品的优点,利用基因工程技术可大量生产生理活性蛋白和多肽,提供足够数量的生理活性物质，以便深入地研究,能发掘更多的内源性生理活性物质,能改造存在缺点的活性物质,以便获得新型化合物，扩大药物筛选来源,基因工程药物制药的主要程序,:,目的基因的克隆，,构建DNA重组体，,DNA重组体转入宿主菌，,构建工程菌，,工程菌发酵，,表达产物的分离纯化，,产品的检验等。,基因工程药物制药的一般程序,获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）,培养工程菌 产物分离纯化 除菌过滤,半成品检定 成品检定 包装,第三节 目的基因的获得,克隆原核基因的常用方法：Polymerase Chain Reaction(PCR),原核基因一般不含有内含子，可以直接运用PCR方法扩增出目的基因。,克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。,一、逆转录法,逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。,mRNA的纯化,cDNA第一链的合成,cDNA第二链的合成,cDNA的克隆,将重组体导入宿主细胞,cDNA文库的鉴定,目的cDNA克隆的分离和鉴定,RT,PCR,A,：第一步,PCR,扩增出单链,cDNA,B,：第二步,PCR,扩增出双链,cDNA,P1,：,5,端引物,P2,：,3,端引物,RNA的提取,推荐运用快速，简便的提取方法，如：一步法提取t,RNA,。,RNase 无处不在且能耐受高于100,的高温。,mRNA稳定性差，半衰期短，长度大的mRNA易断裂,RNA的提取的关键：,避免,RNase的污染,，提取步骤简单快速，操作温和。,mRNA的纯化,运用oligo-dT-cellulose 经过NaOH处理后，对tRNA中的mRNA进行纯化,2 1,1,：猪肾组织中提取的总,RNA,2,：总,RNA,经纯化后得到的,mRNA,从猪肾组织中提取的RNA,cDNA第一链的合成,oligo-dT（30）作为引物，在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成出cDNA第一链,cDNA第二链的合成,RNase酶解去处cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链，以cDNA第一条链为模板，,3端形成的发卡结构作为引物合成第二链。,也可以用一对特异性引物合成双链cDNA,pACY1 cDNA的扩增,1:,以,mRNA,为模板，用,pfx DNA Polymerase,进行扩增,2以总,RNA,为模板，用,pfx DNA Polymerase,进行扩增,3:,以总,RNA,为模板，用,Tag DNA Polymerase,进行扩增,4:,以,mRNA,为模板，用,Tag DNA Polymerase,进行扩增,5:,不加任何模板，用,pfx DNA Polymerase,进行扩增,M:200bp DNA Ladder(,其中最亮的条带为,1.0kb),二、化学合成法,较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。,必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。,用化学法合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。,人工化学合成基因的限制有：,不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡核苷酸片段仅为 50 60 bp，因此,只适用于克隆小分子肽的基因。,遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。,费用高。,DNA的克隆,载体分为克隆载体（常用于保存基因）和表达载体。表达载体转入宿主菌细胞中，经诱导剂或其它诱导条件的诱导，使启动子激活从而表达出目的蛋白。,在表达载体中的目的基因在宿主菌的传代过程中易于丢失,克隆载体,胞内表达载体分泌型表达载体,克隆策略,加同聚尾连接。,用,T-,载体,(,pGEM,-T,promega,),连接。,这是利用,Taq,DNA Polymerase,特性,。,加上人工接头，通常是内切酶位点序列（定向克隆）。,平齐末端连接。,pACY1 cDNA,克隆示意图,pACY1 cDNA,与,pGEM,T,之间的连接反应,反应1,反应2,反应3,阳性对照,阴性对照,10T4 DNA Ligase Buffer,1L,1L,1L,1L,1L,pGEMT（50ng/L）,1L,1L,1L,1L,1L,PCR 产物,1/3X,X,3X,对照插入DNA,2L,T4 DNA Ligase(3U/L),1L,1L,1L,1L,1L,去离子水加至,10L,10L,10L,10L,10L,将重组体导入宿主细胞,转化或转染的方式导入,宿主细胞,常用的转化方法：CaCl2法，电转化。,转染方法用于病毒载体转化细胞。,DNA,重组子的鉴定和分离,利用菌斑的抗生素抗性和菌斑及噬菌斑的颜色来鉴定,用PCR进一步鉴定目的基因是否插入在载体中,酶切（内切酶处理）后，用agarose凝胶电泳鉴定插入方式是否正确。,序列测定,PCR,筛选阳性克隆,1,5:,不同的单菌落，出现,1.2kb,特异性扩增为阳性克隆,M:200bp DNA Ladder(,其中最亮的条带为,1.0kb),序列测定,