第一章--生化实验技术-绪论.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生化实验技术-绪论,(二)生物化学的发展史,静态生化阶段：大约从十八世纪中叶到二十世纪初。主要是大分子物质的,分离和鉴定,.,动态生化阶段：从,20,世纪初到,20,世纪,50,年代。主要是大分子物质的功能研究，如代谢途径。,分子生物学阶段：从,1953,年至于今。分子水平研究,.,(三)生物化学实验技术发展简史,生物科学在,20,世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在,21,世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。,20,年代的超离心技术,微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现；,瑞典著名的化学家,T.Svedberg,奠基了“超离心技术”，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了,1926,年的诺贝尔化学奖。,50,年代放射性同位素示踪技术,放射性同位素示踪技术在,50,年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用；,1935,年,Schoenheimer,和,Rittenberg,首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究。,60,年代的,X-,射线衍射技术,各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如,HPLC,技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、,NMR,核磁共振技术等；,自,1958,年,Stem,，,Moore,和,Spackman,设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作；,1967,年,Edman,和,Begg,制成了多肽氨基酸序列分析仪,.,在,X-,射线衍射技术方面，英国物理学家,Perutz,对血红蛋白的结构进行,X-,射线结构分析,Kendrew,测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获,1962,年诺贝尔化学奖。,英国科学家,Wilkins,通过对,DNA,分子的,X-,射线衍射研究证实了,Watson,和,Crick,的,DNA,模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。三人获,1962,年诺贝尔生理医学奖，,此外，层析和电泳技术又有了重大的进展，在,1968,1972,年,Anfinsen,创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。,1969,年,Weber,应用,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展,.,70年代DNA序列测定仪、合成仪,基因工程技术取得了突破性的进展；,生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了,DNA,序列测定仪,、,DNA,合成仪等；,1972,年，美国斯坦福大学的,Berg,等人首次用限制性内切酶切割了,DNA,分子，并实现了,DNA,分子的重组。,1973,年，又由美国斯坦福大学的,Cohen,等人第一次完成了,DNA,重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，,Cohen,成为基因工程的创始人；,到,1973,年,Moore,和,Stein,设计出氨基酸序列自动测定仪；,80年代的PCR技术,基因工程技术进入辉煌发展的时期。,1980,年，英国剑桥大学的生物化学家,Sanger,和美国哈佛大学的,Gilbert,分别设计出两种测定,DNA,分子内核苷酸序列的方法，而与,Berg,共获诺贝尔化学奖；,1981,年由,Jorgenson,和,Lukacs,首先提出的高效毛细管电泳技术,(,HPCE,),；,1984,年德国科学家,Kohler,、,美国科学家,Milstein,和丹麦科学家,Jerne,由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。,1985,年美国加利福尼亚州,Cetus,公司的,Mullis,等发明了,PCR,技术（,Polymerase Chain Reaction,）,即聚合酶链式反应的,DNA,扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的,Smith,共享,1993,年的诺贝尔化学奖；,1988,年，美国遗传学家,McClintock,由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖；,1989,年，美国科学家,Altman,和,Cech,由于发现某些,RNA,具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。,九十年代的克隆技术,1993,年，美国科学家,Roberts,和,Sharp,由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖；,1994,年，美国科学家,Gilman,和,Rodbell,由于发现了,G,蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖；,1995,年，美国科学家,Lewis,、,德国科学家,Nusslein-Volhard,和美国科学家,Wieschaus,由于在,20,世纪,40,70,年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖；,1997,年，克隆羊多利的诞生。,2000,年,6,月,26,日，美国、英国、法国、德国、日本和中国的科学家宣布：“人类基因组草图”的绘制工作已全部完成；,标志着后基因组时代的诞生，进入功能基因组时代。,21世纪初人类基因组计划完成,(三)生物化学研究的主要内容,1、生物体的化学组成、结构与功能,20,种编码的氨基酸；,5,种芳香族碱基：,2,种嘌呤和,3,种嘧啶；,2,种单糖：葡萄糖和核糖；,脂肪酸：甘油和胆碱,.,以上前体组成了糖类、蛋白质、核酸和脂类生物体的四大类基本物质,2,、物质代谢及调控,新陈代谢metabolism),是生物的基本特征之一。新陈代谢又称物质代谢，指生物与周围环境进行物质交换和能量交换的过程,.,同化作用,(assimilation),，,合成代谢,；,异化作用,(dissimilation),，,分解代谢,；,3,、遗传信息的传递与表达,生物性状的遗传是靠核酸与蛋白质为物质基础的；,DNA,是遗传信息的载体；,DNA-mRNA-,蛋白质；,基因工程、蛋白质工程、酶工程等到高科技工程造福人类是现今研究的热点,.,(四)生物化学与其他学科的关系,生物化学与有机化学与生理的关系；,生物化学与微生物、细胞、遗传的关系；,生物化学与生物物理学、近代药理学等的关系；,越来越多的其他学科的科学家都参与到生物化学研究中来，使生物化学有了突飞猛进的发展,.,(五)生物化学的应用与前景,生化知识的应用；,生化技术的应用；,生化产品的广泛应用。,小 结,生命科学以全新的面目进入,21,世纪；,从生物大分子和生物膜的结构、性质和功能的关系来阐明生命过程的一些基本问题，生物化学是其基础和核心；,生物工程是,21,世纪新兴产业的基础技术之一；,人干扰素、生长素、肝炎疫苗等珍贵药物,已得到广泛应用,第二节 实验注意事项,一、实验室规则,预习实验内容,；,遵守实验室纪律,；,听从教师指导；,保持实验室清洁整齐；,节约试剂；,配制的试剂要标记；,对腐蚀性或有毒性试剂要按规则处理；,贵重精密仪器应严格遵守操作规程；,实验室内严禁吸烟、饮水和进食；,实验完毕必须洗净并放好各种玻璃仪器，保持实验室卫生；,检查电源、水源开关。,二、,实验室安全及防护知识,严防,“五毒”，即着火、爆炸、中毒、触电和割伤,1、着火,名称,沸 点/,闪 点/,自燃点/,乙 醚,34.5,40,180,丙 酮,56,17,538,二硫化碳,46,30,100,苯,80,11,乙醇(95),78,12,400,闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度；,自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度；,由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。,严禁在开口容器和密闭体系中用明火加热有机溶剂，只能使用加热套或水浴加热。,废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道。,不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。,在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。,预防火灾必须严格遵守以下操作规程,灭火方法,要保持镇静灭火或立即报火警（火警电话,119,）。,乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。,导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用,1211,灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。,个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。,2、爆炸,爆炸原因：,常见的引起爆炸事故的原因有：,随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。,在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。,在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器，或反应过于激烈而失去控制。,易燃易爆气体大量逸入室内。,高压气瓶减压伐摔坏或失灵。,加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物氧化铜、浓硫酸高锰酸钾、三氯甲烷丙酮等。,易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限,名 称,爆炸极限(体积百分数),名 称,爆炸极限(体积百分数),乙醚,1.936.5,丙酮,2.613,甲醇,6.736.5,乙醇,3.319,氢气,4.174.2,乙炔,3.082,3、中毒,生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴乙锭等；,剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。,中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。,中毒的预防,保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行；,取用毒品时必须配戴橡皮手套；,严禁用咀吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋；,不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。,中毒急救的方法,误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服,Mg(OH)2,乳剂，最后饮些牛奶；,吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法；,砷和汞中毒者应立即送医院急救。,3、外伤,化学灼伤：,眼睛灼伤或掉进异物：眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗十五分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。若有玻璃碎片进入眼内则十分危险，必须十分小心谨慎，不可自取，不可转动眼球，可任其流泪，若碎片不出，则用纱布轻轻包住眼睛急送医院处理。若有木屑、尘粒等异物进入，可由他人翻开眼睑，用消毒棉签轻轻取出或任其流泪，待异物排出后再滴几滴鱼肝油。,皮肤灼伤：,酸灼伤：先用大量水洗，再用稀,NaHCO3,或稀氨水浸洗，最后再用水洗。,碱灼伤：先用大量水冲洗，再用硼酸或醋酸浸洗，最后再用水洗。,溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用,20,硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。,割伤：这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，切不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，就医时务必检查伤部神经是否被切断。,3、触电,防止触电：,不能用湿手接触电器。,电源裸露部分都应绝缘。,坏的接头、插头、插座和不良导线应及时更换。,先接好线路再插接电源，反之先关电源再拆线路。,仪器使用前要先检查外壳是否带电。,如遇有人触电要先切断电源再救人。,防止电器着火,:,保险丝、电源线的截面积、插头和插座都要与使用的额定电流相匹配。,三条相线要平均用电。,生锈的电器、接触不良的导线接头要及时处理。,电炉、烘箱等电热设备不可过夜使用。,仪器长时间不用要拔下插头，并及时拉闸。,电器、电线着火不可用泡沫灭火器灭火。,三、实验记录,详细、准确、如实地作好实验记录是极为重要的，记录如果有误，会使整个实验失败，这也是培养学生实验能力和严谨的科学作风的一个重要方面。,每位同学必须准备一个实验记录本，实验前认真预习实验，看懂实验原理和操作方法，在记录本上写好实验预习报告，包括详细的实验操作步骤,(,可以用流程图表示,),和数据记录表格等。,记录本上要编好页数，不得撕缺和涂改，写错时可以划去重写。不得用铅笔记录，只能用钢笔和园珠笔。记录本的左页作计算和草稿用，右页用作预习报告和实验记录。同组的两位同学合做同一实验时，两人必须都有相同、完整的记录。,实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据，条理清楚，字迹端正，切不可了草以致日后无法辨认。实验记录必须公正客观，不可夹杂主观因素。,实验中要记录的各种数据，都应事先在记录本上设计好各种记录格式和表格，以免实验中由于忙乱而遗漏测量和记录，造成不可挽回的损失。,实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“,0.050”,，而不能记成“,0.05”,。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。,实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其重量等；试剂的规格、化学式、分子量、试剂的浓度等，都应记录清楚。二人一组的实验，必须每人都作记录。,四、实验报告,实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对有关生物化学与分子生物学原理和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。,实验报告的格式应为：,实验目的；,实验原理；,仪器和试剂；实验步骤；,数据处理；,结果讨论。,实验报告的写作水平是衡量学生实验成绩的一个重要方面；,实验报告必须独立完成，严禁抄袭；,必须详细记录实验现象的所有细节；,实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键；,实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅资料。,五、实验室基本操作,玻璃仪器的清洗；,塑料器皿的清洗；,洗液的配制；,缓冲溶液与,pH,测定,.,缓冲溶液,缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持,pH,值基本不变的溶液。该溶液的这种抗,pH,变化的作用称为缓冲作用。,生物化学常用缓冲液：,磷酸盐缓冲液；,Tris,缓冲液；,有机酸缓冲液；,硼酸盐缓冲液；,氨基酸缓冲液；,两性离子缓冲液，又称,Goods,缓冲液；,