第七章-外源性化合物致突变.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,联系方式,单击此处添加文本,电话：,13828469568,短号：,659568,邮箱：,181102293,目的及要求,遗传和变异是生物界的普遍生命现象，是保证生物世代间生命延续的基本内容，本章介绍的就是外源化学物对遗传变异的影响。,要求掌握突变、致突变的相关概念以及致突变类型，致突变实验的遗传学终点和实验组合的选择以及相关的实验内容。,遗传毒理学,（,Genetic toxicology,）,第一节 概述,第二节 化学毒物致突变的类型,第三节 致突变作用机制和后果,第四节 机体对致突变作用的影响,第五节 观察化学毒物致突变作用,的基本方法,基本概念,变异,（,variation,）,-,亲代之间或子代个体之间出现不同程度的差异，这种差异称为变异,突变,(Mutation)-,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,按突变原因分为,自发突变,(spontaneous mutation),和,诱发突变,(induced mutation),，自发突变与物种的进化有关；诱发突变指人为的造成突变。,致突变作用,（,mutagenesis,）,-,外来因素引起细胞核中遗传物质发生改变的能力。致突变物又称诱变剂,（,mutagen,）,-,能够引起突变的物质为致突变物。,研究外源化学物及其他环境因素,对生物体遗传机构的损害作用及其规律，,是毒理学的一个分支。,其主要目的是检测那些,能引起,DNA,损伤的环境因素,，研究其,遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害,。,遗传毒理学,(Genetic Toxicology),第二节 化学毒物致,突变的类型,遗传学相关基本知识,DNA,的组成,脱氧核糖、磷酸、碱基,DNA,的功能,碱基的排列顺序蕴含着遗传信息；,DNA,最主要的功能是编码蛋白质。,DNA的复制与翻译,复制：半保留复制,翻译：中心法则,遗传学相关基本知识,碱基置换,(basepair substitution),指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变，,分为转换,(transition),和,颠换,(transvertion),两种,，如图,：,一、基因突变,(gene mutation),T,A,G,C,转换,颠换,基因突变,-,转换与颠换示意图,Base-pair Substitutions,蛋氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,蛋氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,蛋氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,蛋氨酸,赖氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,丝氨酸,移码突变,(frame shift mutation),指发生,一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加,，以致,从受损点开始碱基序列完全改变,，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。,frameshift mutation,Frame shift mutation,蛋氨酸,赖氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,蛋氨酸,蛋氨酸,蛋氨酸,赖氨酸,亮氨酸,丙氨酸,苯丙氨酸,甘氨酸,后果,同义突变,(synonymous mutation),：,指没有改变基因产物氨基酸序列的改变,错义突变,（,missense mutation),：,指碱基 序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变,Missense mutation,无义突变,(nonsense mutation),：,指某个碱基的改变使代表某个氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致多肽链在成熟之前终止合成的改变,终止密码突变,链终止突变：指无义突变使肽链过早终止,延长突变：指如果终止密码子因突变而为氨基酸编码，结果产生过长 的肽链的现象,指染色体的结构改变,染色单体型畸变,(chromatid-type aberration),染色体型畸变,(chromosome aberration),染色体畸变,裂隙,(gap),断裂,(break),断片,(fragment),和缺失,(deletion,),微小体,(minute body),无着丝点环,环状染色体,双着丝点染色体,倒位,(inversion,),易位,(translocation,),插入,(insertion),和重复,(duplication,),辐射体,二、染色体畸变,(chromosome aberration),（,1,）缺失,染色体少了某一片段,通常是致死的（,2,）重复,染色体上多出了一段（,3,）倒位,染色体内部结构的顺序发生颠倒（,4,）易位,染色体断裂，断裂片断接到其他地方,染色体结构畸变的类型,缺失,(deletion),A,B,C,F,D,E,G,H,B,C,F,A,D,E,G,H,B,C,C,B,F,A,D,E,G,H,B,C,A,B,C,F,D,E,G,H,B,C,NormalTandem,顺接重复,Reverse,反接重复,Displaced,异位重复,重复,(duplication),A,B,C,F,D,E,G,H,B,C,A,A,B,C,F,D,E,G,H,B,C,A,A,F,D,E,G,H,B,C,F,A,D,E,G,H,B,C,Overlap of homologues,Simultaneous break,Reunion of homologues,A,B,C,F,D,E,G,A,B,C,F,D,E,G,A,B,C,F,D,E,G,Paracentric,A,B,C,F,D,E,G,A,B,C,F,D,E,G,A,C,B,F,E,D,G,Pericentric,倒位,(inversion),倒位的类型,1),、,臂内倒位,(paracentric inversion)2),、,臂间倒位,(pericentric inversion),倒位片段不含着丝粒。倒位片段含着丝粒。,易位,(translocation),易位的类型,1),、,相互易位,(reciprocal translocation),非同源染色体之间相互置换了一段染色体片段。,2),、,简单易位,(interstitial translocation),一条染色体片断插入到非同源染色体区段之中。,3),、,罗伯逊式易位,(Robertsonian translocation),也称着丝粒融合或整臂融合。由两个非同源的端着丝粒染色体的长臂相互重接成一条长的中央着丝粒染色体；短臂相互连接成交互的产物，常在细胞分裂中丢失。,A,B,C,F,D,E,M,N,Q,O,P,A,F,D,E,M,N,Q,O,P,B,C,Interstitial translocation,间质异位,A,B,C,F,D,E,M,N,Q,O,P,A,B,C,Q,O,P,M,N,F,D,E,Reciprocal translocation,相互异位,Robertsonian translocation,三、非整倍体和多倍体,非整倍体,(aneuploid),指细胞丢失或增加一条或几条染色体。,缺失一条染色体时称为单体,(monosome),增加一条染色体时称为三体,(trisome),染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。,如,21,三体导致先天愚型,(Down,氏综合征,),。,整倍体,(euploid),指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，,如形成三倍体,(triploid),、,四倍体,(tetraploid),等。,在人体，,3n,为,69,条染色体，,4n,为,92,条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。,诱发突变,基因突变,染色体,畸变,碱基置换,（错配）移码突变,（缺失、插入）,大段损伤,结构异常,缺失,(deletion),重复,(duplication),倒位,(inversion),易位,(translocation),臂间倒位,臂内倒位,数目异常,非整倍体（,aneuploidy,）,多倍体,(polyploid),转换,(transition),颠换,(transversion),第三节 致突变作用机制和后果,一、引起突变的,DNA,变化,（一）碱基损伤,1.,碱基错配,烷化剂,(alkylating agent):,是指对,DNA,和蛋白质具有强烈烷化作用的物质 一般情况下,甲基化乙基化高碳烷基化,目前认为最常受到烷化的是,鸟嘌呤的,N,7,位，其次是,O,6,位,腺嘌呤的,N,1,、,N,3,和,N,7,也易烷化,AP,位点,（,apurinic or apyrimidinic site),：,是指丢失碱基的,DNA,留下了一个,无嘌呤或无嘧啶的位点,2.,平面大分子嵌入,DNA,链,嵌入剂,（,intercalating agent),：,指能,以静电吸附形式嵌入,DNA,单链的碱基之间或,DNA,双螺旋结构的相邻多核苷酸链之间的物质,如丫啶类染料分子多数是多环的平面结构，特别是三环结构，其长度为,6.8,10 2 nm,，恰好是,DNA,单链相邻碱基距离的两倍,通常引起移码突变,3.,碱基类似物取代,有些化学物的结构与碱基非常相似，称碱基类似物,它们能在,S,期中可与天然碱基竞争，并取代其位置,例如,5,溴脱氧尿嘧啶,能取代,胸腺嘧啶核苷,；,2,氨基嘌呤,(2-AP,）,能取代,鸟嘌呤,bromodeoxyuridine,Thymine,4.,碱基的化学结构的改变或破坏,化学物可对碱基产生氧化作用，从而破坏或改变碱基的结构，基于引起链断裂,有些化学物质可在体内形成有机过氧化物或自由基，如甲醛、氨基甲酸乙酯和乙氧咖啡碱等，可间接使嘌呤的化学结构破坏，容易出现,DNA,链断裂,（二）,DNA,链受损,1.,二聚体的形成：,紫外线 环丁烷嘧啶和,4-6,光产物 阻止,DNA,复制 引起细胞死亡,Thymine dimers produced by ultraviolet irradiation,2.DNA,加合物形成,（,DNA adducts,）,活性化学物质与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物。,如生物毒素、多环芳烃和芳香胺类致癌物可使,DNA,形成大加合物，使,DNA,的立体构象发生明显变化，阻断受损部位的半保留复制和转录,3.DNA-,蛋白质交联,（,DNA-protein crosslinks,，,DPC,）,四、突变的后果,突变的后果取决于化学毒物所作用的靶细胞,体细胞：,其影响仅能在直接接触该物质的个体身体上表现出来，不可能遗传到下一代,生殖细胞：,其影响有可能遗传到下一代,二、引起突变的细胞分裂过程改变（自学）,三、其他改变（自学）,突变的不良后果,1.,生殖细胞突变的后果,（,1,）致死性突变：,显性致死：,突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡,.,隐性致死：,需要纯合子或半合子才能出现死亡效应现,.,（,2,）非致死性突变（可遗传的改变）,先天畸形等遗传性疾病,遗传易感性改变,生物个体生殖细胞发生突变或染色体畸变后，有些可能会在世代传递、选择过程中在人群中固定下来，增加人类的遗传负荷,遗传负荷,（,genetic load),：,指人群中每个个体所携带有害基因或致死基因的平均水平,2.,体细胞突变的后果,（,1,）癌变：体细胞突变是细胞癌变 的重要基础，在许多肿瘤中，都可观察到癌基因的活化和抑癌基因的失活，并存在缺失、易位、倒位等染色体畸变,（,2,）致畸胎：致突变物可透过胎盘作用于胚胎体细胞引起畸胎，所以致畸作用不完全是亲代生殖细胞突变的后果,（,3,）其他不良后果：动脉粥样硬化、衰老,第四节 机体对致突变作用的影响,机体修复,DNA,损伤的机制可分为两大类：,损伤耐受机制：指,DNA,遗传可绕过那些阻止,DNA,复制的,DNA,损伤。,DNA,修复,直接修复,切除修复,O,6,甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,复制后修复,呼救性修复,DNA,损伤的修复机制,（一）、,DNA,损伤的修复X,射线损伤修复交叉互补基因（,XRCC1,）是一种重要的,DNA,修复蛋白在内外氧剂及烷化剂导致的,DNA,单链断裂和碱损伤修复中起重要作用，,XRCC1,能通过自身的不同部位与多种碱基切除修复相关蛋白结合，发生相互作用促进对,DNA,损伤修复，对维持基因组的稳定起关键作用，并参与顺铂（,DDP,）或卡铂（,CBP,）引起的损伤修复过程。,DNA,修复能力是与肿瘤易感性和肿瘤化疗敏感性密切相关的双刃剑：,DNA,修复能力强，肿瘤易感性低，然而在肿瘤治疗过程中，修复能力的增加却阻碍了化疗药物的发挥。多年来，国内外学者对,XRCC1,的多态性做了相关的研究，主要集中在,Argl94Trp,和,Arg399Gln,位点，发现由于,XRCC1,存在多态性,不同个体的活性不一样,从而导致对铂类药物化疗敏感性的不同。,DNA,损伤修复的一般特点,1.DNA,损伤不仅可因外源性因素所致，也可因内源性因素所致,2.,不同类型,DNA,损伤通过不同的,DNA,修复途径修复,3.,不同类型,DNA,损伤修复速度是不同的,4.DNA,损伤修复机制有些是基本的，有些是可诱导的,5.DNA,损伤修复功能存在物种和个体差异,突变模式：,DNA,损伤,-,修复,-,突变,任何,DNA,损伤，只要修复无误，突变就不会发生，如果修复错误或未经修复，损伤就固定下来，于是发生突变,（二）、遗传因素对致突变作用的影响一,),代谢酶遗传多态性,(,二,),修复功能的个体差异,第五节 观察化学毒物致突变 作用的基本方法,一、观察项目的选择,1,、观察的效应终点类型,基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。,将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为遗传学终点,(genetic endpoint),。,遗传学终点分为,5,类,DNA,完整性的改变,(,形成加合物，断裂，交联,),；,DNA,重排或交换；,DNA,碱基序列改变；,染色体完整性改变；,染色体分离改变。,其中实际上指基因突变，指染色体畸变。,2,成套的观察项目,遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：,化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样,;,致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用,;,化学毒物的致突变性有强，也有弱。,遗传毒理学成套观察项目中试验入选原则：,选择的遗传毒性试验应包括,5,种类型的遗传学终点。,通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。,体内试验与体外试验配合。,应包括生殖细胞和体细胞。,二、常用的致突变试验,(一,),细菌回复突变试验,(Ames,试验,),左图,：,发明,ames test,的,美国加州大学教授,艾姆斯（,B.N.Ames,）,，,依然建在。,原 理,鼠伤寒沙门氏菌,野生型（原养型）,人工方法正向诱变,鼠伤寒沙门氏菌,组氨酸缺陷型（异养型）,诱变物作用回复突变,Ames,是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变,TA1537,TA1538,TA1535,R,因子,R,因子,R,因子,TA97,TA98,TA100,TA102,移码突变,碱基置换突变,移码突变、碱基置换突变,实验菌株,Petri dishes containing sodium azideinduced revertants of tester strain TA1535.The top left dish(no chemical added)shows spontaneous revertant colonies.The increase in induced revertants reflects increases in the concentration of sodium azide.,(,二,),微核试验,微核,(Micronucleus),的产生与染色体损伤有关，,是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。,细胞质中微核来源有二：,微核试验,(Micronucleus test,，,MNT),是观察受试物能否产生微核的试验。,其主要可检出,DNA,断裂剂和非整倍体诱变剂。,MICRONUCLEUS TEST,(,三,),染色体畸变分析,(,四,),姐妹染色单体交换试验（,SCE,）,(,五,),果蝇伴性隐性致死试验,(,六,),显性致死试验,(,七,),程序外,DNA,合成试验,(,八,),单细胞凝胶电泳,(,九,),观察方法新进展,三、致突变试验中的一些问题,(,一,),阴性和阳性对照的设立,1,、阴性对照,（,negative control,）,它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。,2,、阳性对照,（,positive,control,）,是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。,其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠,(,二,),体外试验的活化系统,S9,S9,指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经,9000g,离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶,(MFO),。,其缺点是,S9,随实验动物种属或器官不同而有差异；,S9,含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。,(,三,),致突变试验与致癌试验的关系,已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。,发现人类接触致癌物与,DNA,加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。,传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。,(,四,),试验结果在毒理学安全性评价中的作用,阴性结果判定条件：,最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。,各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。,满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。,阳性结果应具有剂量,反应关系，,即随剂量增加，致突变作用增加；,和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。,阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。,阳性结果判定条件,思考题,突变的类型有哪些？,化学物致突变作用的检测遗传学终点有哪些？,为什么要用成套的实验来检测致突变作用？,Ames,实验的原理？常用的菌株？,微核的来源有哪些？,Thank you!,