第3章-基因工程制药-第2节-基因工程药物的分离纯化.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,含有大量细胞及代谢产物；,表达产物稳定性差，易失活变性；,表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；,对其质量要求纯度高、无菌、无热原。,一、建立分离纯化工艺的根据,含目的产物的起始料的特点,基因工程菌的发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：,菌种的类型及其代谢特性。,原材料培养基的来源及其质量。,生产工艺及条件。,物料中杂质的种类和性质。,目的产物特性。,产品质量的要求,收率要高。,两个技数间能直接衔接，,不需要对物料加以处理。,纯化过程要快，满足高,生产率的要求。,细胞破碎与固液分离,细胞收集：离心法、膜分离法。,细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法。,固液分离,普通超声破碎仪,高压细胞破碎仪,目的产物的分离纯化,目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化。,蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定。,产 物 特 性 作 用,等电点 决定离子交换种类及条件,相对分子量 选择不同孔径的介质,疏水性 与疏水、反相介质结合的程度,生物特异性 决定亲和配基,溶解性 决定分离体系及蛋白浓度,稳定性 决定工艺采用温度及流程时间,产物的特性在分离纯化中的作用,分离纯化的方法依赖,色谱分离方法,Chromatography,概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有,固定相,（多孔介质）和,流动相,，根据物质在两相间的,分配行为不同,（由于亲和力差异），经过,多次分配,（吸附-解吸-吸附-解吸），达到分离的目的。,色谱分离方法的分类,色谱分离方法很多，种类有四、五十种,但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分，,有以下几种：,吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,凝胶色谱,色谱系统的基本组成,色谱分离的基本概念,分配系数,可由,Langmuir,方程得出,K,d,-分配系数,q、c-溶质在固相和液相中的浓度,保留时间（,t,R,）,和保留体积（,V,R,）,反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力学参数之一,阻滞因子Rt,阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比,其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小,洗脱体积,色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积,不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异,色谱柱的理论塔板数、塔板高度,反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系,理论塔板数的计算方法：,N-理论塔板数 tR-保留时间,W,1/2,-半峰宽 Wb-峰底宽度,理论塔板高度：L-柱长,离子交换层析（ion exchange chromatography IEC）,离子交换层析的基本原理是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。,它具有分辨率高容量大操作容易，该法已成为多肽蛋白质核酸分离纯化的重要方法。,常用的离子交换树脂,葡聚糖凝胶型,DEAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-25，CM-Sephadex C-25，SP-Sephadex C-25,纤维素系列离子交换剂,DEAE-Sephacel Cellex系列,琼脂糖系列离子交换剂,Sepharose系列 Sepharose CL-6B,Sepharose Fast Flow,Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂,Source 系列离子交换剂,特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低,阳离子交换树脂 S系列,阴离子交换树脂 Q系列,MonoBeads 系列离子交换剂（Pharmacia）,特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。,同样分为Q系列和P系列,Mini Q PC 3.2/3:Glutathione synthetase,SDS-PAGE,Starting material,Peak 2,反相色谱,（reversed phase chromatography，RPC）,和,疏水色谱,（hydrophobic interaction chromatography，HIC）,反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。,反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小差异进行分离的。,原理,载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m）,Hypersil Spherosil XOB075,固定相：C,18,、C,8,烷基链，C,8,适于分离蛋白质,C18适于分离核酸,苯基,流动相的选择,通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇和四氢呋喃,由于固定相骨架疏水性强，吸附的蛋白质需用有机溶剂才能洗脱下来。,30,m,15,m,5,m,Influence of Particle Size on the Separation effect,疏水色谱的原理与反相色谱的原理相似，主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用力增强。,固定相介质表面的疏水性比反相色谱介质表面的疏水性弱。为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相。,流动相为pH68盐水溶液。,Mechanism of HIC,在高盐浓度时，蛋白质分子中疏水性部分与介子的疏水基团产生疏水性作用而被吸附；盐浓度降低时蛋白质疏水性作用减弱，目的蛋白质被逐步洗脱下来，蛋白质疏水性越强，洗脱时间越长。,与反相色谱相比，疏水色谱回收率较高，蛋白质变性可能性小。,凝胶色谱填料,葡聚糖凝胶,Sephadex G-系列,聚丙烯酰胺凝胶,Sephacryl系列,琼脂糖凝胶,Sepharose系列,Superose系列,亲和层析（affinity chromatography，AC）,亲和层析是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附，如抗体与抗原、受体与激素、酶与底物之间的作用,。,载体活化、配基连接、吸附、洗脱,配基：在亲和层析中起可逆性结,合的特异性物质。,载体：与配基结合的支撑物。,亲和层析大体可分三步：,配基固定化,吸附目的物,样品解吸,凝胶过滤,凝胶过滤是以具有大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。,优点：操作简便,分离效果好，重复性高，回收率高,分离条件温和,应用广泛 适用于生物大分子的初级分离，脱盐,分辨率低,Desalting proteins,proteins,salts,根据蛋白质的相对分子量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异，可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。,主要应用两个方面：,脱盐和更换缓冲液,蛋白质分子的分级分离。,在产品的形成阶段前用于除去产物的多聚体及降解产物。,非蛋白质杂质的去除,DNA、热原质和病毒的纯化方法：,DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。,热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。,病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。,非蛋白质杂质的去除,DNA、热原质和病毒的纯化方法：,DNA的去除 DNA在pH4.0以上呈阴离子，蛋白质的pI在6.0以上,可用阴离子交换剂吸附除去。如蛋白质为强酸性，可选择条件使其吸附在阳离子交换剂上，而DNA不吸附。亲和层析和疏水层析也有效。,热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法。,病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除。,四、选择分离纯化方法的依据,根据产物表达形式来选择,分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。,产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式,它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于,分离纯化.为了获得周质蛋白,经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得。,可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层析。,根据分离单元之间的衔接选择,应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段。,先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段，即通常先运用非特异、低分辨的操作单元（如沉淀超滤和吸附等），以尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要杂质（包括非蛋白类杂质）。,随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。,层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡。如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤。,根据分离纯化工艺的要求来选择,分离纯化工艺应遵循以下原则：,具有良好的稳定性和重复性,尽可能减少组成工艺的步骤,各技术步骤间要相互适应和协调,工艺过程中尽可能少用试剂,工艺所用时间要短,工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低,具有较高的安全性,