第9章--目的基因表达.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,原核生物基因的表达调控,原核生物的主要转录调控方式,原核细胞表达体系与表达载体,真核细胞表达体系,展示表达技术,1.,原核生物基因的表达调控,（,1,）染色体,DNA,特点,基因结构简洁有效，无多余序列，必须利用少量的,DNA,序列充分存储必要的遗传信息（操纵子、重叠基因）,一个复制起点（,ori,），一个复制终点（,ter,）,（,2,）基因表达特点,1,种,RNA,聚合酶，多种,因子，通过调控,因子的表达来调控不同种类基因表达,E.coli,有,7,种,70,(,housekeeping),H,E,S,N,F,FecI,转录与翻译同时进行，无转录后加工，翻译后加工方式简单（酶原）,启动子的重要保守区,-35,、,-16,、,-10,区等，,RBS,序列（,SD,序列与起始密码子间隔,3,9,个碱基）,（,3,）基因表达调节特点,调控层次少：酶活调节,-,转录和翻译调节,-,总体调控,以转录调控为主，简单而快速（,mRNA,半衰期比蛋白质短，重新合成,RNA,在能耗上也比重新合成蛋白质少）,激活,葡萄糖浓度高时，细胞内,cAMP,浓度很低，,CRP,无法被激活，即使阻遏蛋白,LacI,失活，操纵子也不能高表达,葡萄糖浓度低造成,cAMP,的大量生成，从而激活,CRP,启动转录，起正调控作用,（2,）阻遏,:Trp,操纵子阻遏,当,Trp,很少时，由,trpR,编码的阻遏蛋白没有活性，不能和操纵基因结合，转录可以起始。,当,Trp,大量存在时，阻遏物可以和作为辅阻遏物,Trp,结合而被激活，然后和操纵基因结合，使转录不能起始。,Trp,反馈阻遏的解除使转录强度提高,70,倍,在大肠杆菌色氨酸操纵子中在存在一种转录的弱化调节，弱化作用的解除可使转录强度升高,8-10,倍。转录的,mRNA,的,5,端存在一段前导链，通过前导链二级结构的变化、色氨酰,-tRNA,（色氨酸）以及核糖体的翻译来控制转录是否继续进行,大肠杆菌色氨酸操纵子,前导链,RNA,二级结构受到氨基酰,-tRNA,分子的调节：,His,、,Trp,、,Phe,等氨基酸操纵子,（,3,）弱化,:Trp,操纵子转录弱化,前导链的特点：,含有一个起始密码子和一个终止密码子,含有两个连续的,Trp,密码子,四段能形成不同二级结构的序列，可以形成终止子结构或抗终止子结构,(,茎环）,一旦转录开始后，核糖体结合在前导链上开始翻译，核糖体紧随在,RNA,聚合酶之后移动。,Trp,缺乏时，由于大多数色氨酰,-tRNA,空载，核糖体在两个连续的,Trp,密码子处暂时停滞或移动变慢，转录出的前导链,2,、,3,区配对形成抗终止子结构，,mRNA,链继续随着,RNA,聚合酶的移动而延长，直到转录出完整的产物。,Trp,充足时，大多数色氨酰,-tRNA,载有,Trp,，核糖体快速通过两个连续的,Trp,密码子并占据前导链,2,区的一部分，使,2,、,3,区不能配对形成抗终止子，而是,3,、,4,区配对，刚好形成终止子结构，,mRNA,链从,RNA,聚合酶上脱落下来，转录提前终止。,前导链,RNA,直接感应终端产物的浓度而改变二级结构：,THI,（,B1,）,-box,、,RFN,（,B2,）,-box,和,B12-box,维生素操纵子、嘌呤操纵子等或与其代谢相关的基因，这种调节结构也称为“,Riboswitch”(,ribonucleotide switch),（,4,）,Riboswitch,可以体外通过对随机,RNA序列的筛选得到可以感应特定代谢物浓度的适配体（,aptamer,），根据该代谢物浓度变化来开关目标基因的表达,3.,原核表达体系,（,1,）启动子,(,基本类型,2,类：组成型和调控型）,lac,启动子,最早应用的表达系统，含,CRP,结合位点及,lacO,，其转录,受,CRP,正调控和,lacI,负调控,。,lacUV5,启动子,Plac,的突变型,能够在没有,CAP,的存在下更有效地起始转录，该启动子在转录水平上,只受,lacI,的调控,，因而随后得到了更广泛采用,-35 -10,tac,启动子,/trc,启动子,trp,启动子,-35,区和,lacUV5-10,区、,lacO,区杂合,启动强度更高（约比,PlacUV5,高,1,个数量级,比,trp,启动子高,3,倍），适合于高表达系统。,tacI(-20,为界限）,tacII(-11,为界，下游为人工合成的,46bp,片段）,trc,启动子和,tacI,类似,受,IPTG,诱导启动子的问题：无诱导物存在时本底表达高（甚至有一些基因不加诱导物时表达水平更恰当）,采用,lacI,突变基因：,lacI,q,，突变后导致阻遏蛋白表达量增加,T7,噬菌体启动子,只有,T7RNA,聚合酶才能使其启动，故可以使克隆基因独自得到表达。,T7RNA,聚合酶的效率比大肠杆菌,RNA,聚合酶高,5,倍左右，它能使质粒沿模板连续转录几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌,RNA,聚合酶有效转录的序列。,这个系统可以高效表达其他系统不能有效表达的基因，但要注意用这种启动子时,宿主中必须含有,T7RNA,聚合酶,，,如,BL21(DE3),菌株,问题：表达强度超强，如何控制？实现诱导表达？,利用,lacUV5,启动子控制,T7RNA,聚合酶基因的表达，实现诱导,在,T7,启动子下游加上数个,lacO,序列，使其变为诱导启动子。,P,BAD,启动子,P,BAD,启动子受阿拉伯糖诱导，无诱导物时本底表达低，启动子效率较高。另外随着诱导物浓度增加，启动表达的细胞比例增加（而转录强度并不增加），即对单个细胞而言表达状态只有“,0”,和“,1”,P,L,启动子,l,噬菌体早期左向转录启动子，强度比,Trp,启动子高,11,倍。,P,L,启动子受控于温敏阻遏物,cIts857,。在低温,(30),时，,cIts857,阻遏蛋白可阻遏其转录。在高温,(45),时，,cIts857,失活，启动子转录。适合于表达对大肠杆菌有毒的基因产物，缺点是温度转换也可诱导热休克基因，其中有一些热休克基因编码蛋白酶。另外不利于大规模生产的应用（升温慢）。,大肠杆菌,典型的,SD,序列,为“,AAGGA”,，枯草芽孢杆菌为“,GGAGG”,，一般来说，,mRNA,与核糖体,16S rRNA(3-AUUCCUCCA-5).,的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，,（,2,）,RBS,序列与起始密码子,在间隔相同的情况下，,U,AAGGA,GG,的,SD,序列比,AAGGA,的,SD,序列能使蛋白质的产量提高,36,倍；,对于同一,SD,序列，存在一,最佳的间隔,。,AAGGA,的间隔为,5-7,个核苷酸，而,UAAGGAGG,的间隔为,4-8,个核苷酸；,对于同一,SD,序列，有翻译所必需的最小间隔。,AAGGA,的最小间隔为,5,个核苷酸，而,UAAGGAGG,的最小间隔约为,4,个核苷酸，以保证起始密码子刚好位于核糖体,P,位。,大肠杆菌中的起始,tRNA,分子可以同时识别,AUG,、,GUG,和,UUG,三种,起始密码子,，但识别频率并不相同，通常,GUG,为,AUG,的,50%,，而,UUG,只及,AUG,的,25%,。在枯草芽孢杆菌中，多数基因的起始密码子为,AUG,，为起始密码子的最优选择。,从,AUG,开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，这一序列不能与,mRNA,的,5,端非编码区形成茎环结构，否则会严重干扰,mRNA,在核糖体上的准确定位,E.coli,B.subtilis,原核生物中普遍存在重叠基因，而且重叠基因之间具有翻译偶联现象：即两个基因的翻译存在固定的计量学关系，机理主要有两种：,核糖体移码或滑动（,40bp,以内），即同一核糖体翻译重叠基因,mRNA,形成二级结构，上游基因的,mRNA,序列将下游基因的,SD,序列掩蔽，只有上游基因翻译后才能破坏二级结构而暴露出下游基因的,SD,序列，核糖体才能结合进行下游基因翻译。,核糖体与,mRNA,结合稳定性在刚开始翻译时较差，遇到二级结构可能会影响翻译效率。而在蛋白质链从核糖体中延伸出来后（约,10,个残基）稳定性较强，通常遇到强度大的二级结构也不会影响翻译。,（,3,）终止子,表达的基因末端的终止子非常重要，可以避免,RNA,聚合酶的通读而合成不必要的,RNA,序列。,通读后多余的,RNA,序列可能会形成不利于基因表达的二级结构,通读会影响下游基因的转录，对于质粒，还会影响其复制。,通常需要在表达载体的多克隆位点下游加上强终止子，对于,T7,启动子这样的强启动子，甚至需要加,2-3,个连续的终止子以防止通读。,同理，也需要防止核糖体,“,通读,”,而产生不必要的蛋白质，一般在表达载体下游连续加上数个终止密码子,(,UAA,U,是,E.coli,中最有效的转录终止序列,),。,（,4,）密码子偏爱性,在基因受体菌中表达基因供体菌中与密码子对应的,tRNA,基因,根据受体菌的密码子偏爱性进行序列优化后重新合成外源基因,（,5,）表达策略,对于蛋白质产品：,采用高拷贝载体、诱导性强启动子、高效,RBS,序列，以保证目的蛋白质的产量,（或低拷贝载体上串联多个基因）,对于代谢物产品：,由于表达的蛋白起到催化剂的作用其量要适中，不能耗费大量碳氮源和能量去合成过量催化剂，既要避免过大的代谢负担，也要避免底物的浪费。,大量研究表明采用中低拷贝数载体（,2030,），中等强度启动子效果较好，也可在染色体上整合进行表达，启动子为强启动子,生产代谢物时通常要表达数个、甚至数十个基因，这些基因之间表达水平的稳定和,协调（拷贝数、启动子和,RBS,强度的优化）,对于菌株的生产性能至关重要。,Mini F,质粒,:12,拷贝,pSC101:5,拷贝,pACYC,（,p15A,复制子）,:1520,拷贝,pBR322,（,ColE1,复制子）,:4055,拷贝,pUC,plasmid,：数百拷贝,融合蛋白技术策略：,外源基因连接到融合的蛋白的,C,端,不必另外设计,SD,序列,同时宿主蛋白,N,端的存在使得外源基因的表达较容易,;,外源蛋白常被宿主细胞的蛋白酶降解,当外源蛋白与宿主蛋白的部分序列融合后,会减低宿主细胞对产物的降解,和宿主外膜蛋白融合，有利于在细胞表面表达（展示），对于底物利用、毒物降解、重金属吸附等有关蛋白表达有利。,和宿主信号肽融合，实现蛋白的胞外分泌（或分泌至周质空间,),，有利于避免蛋白酶降解、有利于蛋白产品的纯化,利用融合蛋白技术将药物和能与病灶特异性结合的配基融合在一起构成融合蛋白,目的蛋白可特异性的与靶细胞结合并将药物导向病灶杀伤、杀死肿瘤细胞达到治疗目的。,与能与亲和层析柱上配基特异结合的“亲和手柄”相融合，利于产物纯化,缺点：由于融合序列的感染，有可能会影响外源蛋白的正常折叠，可以在两者之间加入特殊蛋白酶识别的氨基酸序列，融合表达后酶切产品，去掉融合的非天然序列。,亲和手柄 酶切序列 外源基因,可溶表达和包涵体表达,真核基因在原核细胞中表达易形成包涵体，主要原因为缺乏翻译后修饰导致折叠错误。即使是原核基因，过量表达也会形成包涵体，原因可能为表达量过大，产物来不及正确折叠就发生聚集。,以包涵体形式表达的外源目的产物不具有物理活性,必须溶解包涵体进行复性,才能得到具有生物活性的蛋白。,在通常情况下,包涵体的表达具有可,避免产物被蛋白酶降解,包涵体表达的目的蛋白常在大肠杆菌中,高效表达,目的蛋白的,纯化相对容易,能得到纯度较高的目的蛋白,另外可以,避免毒性,蛋白的毒性。,如果表达的蛋白质用于结构研究,则需可溶性表达，一般需降低表达量、同时表达分子伴侣（大多为热激蛋白，,HSP,heat shocking protein,），以有利于蛋白正确折叠、溶解。,包涵体就是指由于蛋白的空间构象与原来不符，如折叠不对，导致的溶解性降低，就会聚集到一起，形成包涵体。,大肠杆菌,GroEL-GroES,复合体。它由两个堆叠的环和一个帽子结构组成，其中环结构由,GroEL,蛋白组成，在图中以蓝色和绿色表示；帽子结构位于分子的一端，由,GroES,组成，在图中以红色和黄色表示。从分子俯视图可以看出，由,7,个,GroEL,蛋白组成的环结构的中央有一个蛋白质大小的空穴。未折叠的蛋白质就是进入这个空穴，并在其中完成折叠。,分子伴侣,是指细胞内一类能介导其他蛋白正确装配,其自身却不是具有功能的最终装配产物组成成分的物质,（,6,）表达载体,表达系统 亲和手柄 抗原序列 蛋白酶位点 可变区 多克隆位点,保证表达 分纯 定性定量分析 切割融合序列 正确读码 插入片段,Bgl II,常用的抗原序列：,凝血酶，肠激酶，,Xa,因子,常用的蛋白酶：,4.,真核细胞表达体系,基因组特点：,基因组规模大（,10,9,),，有充分的遗传物质，能形成各种特殊的基因结构（内含子，高度重复序列）单基因为主。,组蛋白,+DNA,，形成核小体，进一步压缩成致密的异染色质结构。普遍存在甲基化修饰。,基因表达调控特点：,调控层次多而复杂：,转录前（,DNA,扩增、甲基化）,转录（增强子）,转录后（,mRNA,拼接）,翻译（翻译因子的磷酸化、转铁蛋白等）,翻译后（蛋白质糖基化等修饰）,对遗传信息传递的准确性和稳定性更有利,转录依然是真核生物基因表达调控的主要环节,4.1,真核细胞基因表达特点,启动子特点：,有三种不同的,RNA,聚合酶，因此也有三种不同的启动子，其中以启动子,最为复杂，和原核的启动子有很多不同：,有多种元件：,TATA,框，,GC,框，,CATT,框，,OCT,等，起到控制转录效率和选择起始位点的作用,结构不恒定。有的有多种框盒，有的只有,TATA,框和,GC,框，如,SV40,早期基因启动子。,它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同，,有的有远距离的调控元件存在，如增强子；,不直接和,RNA pol,结合。转录时先和其它转录激活因子（基本转录因子）相结合，再和聚合酶结合,酶的种类,存在,功能,对抑制物的敏感性,RNA,聚合酶,核仁,合成,rRNA,前体,不敏感,RNA,聚合酶,核质,合成,mRNA,前体及大多数,snRNA,低浓度敏感,RNA,聚合酶,核质,合成,5S rRNA,前体、,tRNA,前体及其他的核和胞质小,RNA,前体,高浓度敏感,上游元件：,CAAT box,：,保守序列是,GGCTCAATCT,，一般位于上游,-75-80bp,左右，控制转录起始活性。能和,CTF,（识别,CATT,的转录因子）相结合,GC box,：,保守序列是,GTGGGCGGGGCAAT,，常以多拷贝形式存在,-90,处。它的作用也是控制转录效率。,核心元件：,TATA,T,85,A,97,T,93,A,85,A,63,A,83,A,50,，常在起始位点的上游,-25,左右，相当于原核的,-10,序列，,对转录起始正确定位，控制转录效率。,转录起始位点附近的启始子,（,initiator,，,Inr,）,Py2 CA Py5,构成，位于,-3,+5,，可能提供,RNA pol,识别位点。,远端调控区：,增强子，,其特点是：,具有远距离效应，常在上游,-200bp,处，即使相距十几,Kb,也能发挥作用,无方向性，无论在靶基因的上游，下游或内部都可发挥增强转录作用,顺式调节，只调节同一染色体的靶基因，而对其它染色体上基因无作用,无物种和基因的特异性，可以接到异源基因上发挥作用；,具有组织特异性，如抗体基因的增强子只有在,B,淋巴细胞中才起作用。,其作用和,DNA,构象有关,有的增强子可以对外部信号产生反应，如热,/,激素等,II,类启动子一般由核心元件和上游元件组成。,减弱子，,在某些基因的上游远端或下游远端具有负调节序列，其作用不受距离和方向的影响叫做减弱子。,上游激活序列（,upstream activating seguences UASs,）,UASs,是酵母中远上游序列类似于增强子。它仅影响转录程度，对位点选择不起作用。和增强子不同的是它有方向性，不能在启动子的下游起作用。它结合的转录因子是,GCN4,和,GAL4,，识别位点为,ATGACTCAT,。,静息子：,类似于减弱子，但对基因表达起完全抑制作用，造成基因沉默。,基本,(,通用）转录因子识别,TATA,或者,Inr,，,RNA,聚合酶,II,再和基本转录因子结合形成转录起始复合体，在转录激活蛋白的作用下，复合体起始转录。,初级转录本经过剪切、拼接、,5,端加帽和,3,端加尾成为成熟的可翻译的,mRNA,5,端甲基化的帽子为核糖体结合位点,，和其,40S,亚基发生作用，,40S,亚基结合后沿链滑动到,AUG,处，此时核糖体组装完整（加上,60S,亚基），开始翻译。,除此之外，一些,mRNA,（真核病毒和少数真核基因）在起始密码子上游,还有,IRES,位点,（,internal ribosome entry sites,，内部核糖体进入位点）。这类,RNA,序列能折叠成类似于起始,tRNA,的结构，从而介导核糖体与,RNA,结合（,40S,亚基,P,位点，起始蛋白质翻译）,不同于原核生物的,SD,序列，,IRES,序列长度变化很大，从,9bp,到数百,bp,长，IRES,的存在可以很方便的构建人工的真核操纵子，不同翻译强度的,IRES,序列，也为不同基因的表达协调提供了可选的元件。,如果第一个,ATG,周围的序列符合,KOZAK,序列（,NNNPuNNATGG),小亚基将会在此驻留较长的时间，从而更有利于组装成完整的核糖体，使翻译效率提高,KOZAK,是一个女科学家，她总结出在真核生物中起始密码子两端序列为：,G/N-C/N-C/N-,A,NN,AUG,G,，如,GCCACCAUGG,、,GCCAUGAUGG,时，翻译效率最高，特别是,-3,位的,A,对翻译效率非常重要。该序列被后人称为,Kozak,序列，并被应用于表达载体的构建中。,Kozak,序列为统计规律，第,4,位的偏好碱基为,G,，,AUG,的,5,端约,15bp,范围的侧翼序列内不含碱基,T,。,真核基因表达时通常在,AUG,前需设计,GCCACC,的,kozak,序列，或使用基因上游序列自带的,kozak,序列，避免核糖体出现,leaky scan,KOZAK,序列,NNNPuNNATGG,4.2,真核诱导表达体系,对于组成型表达系统，常用来源于病毒的启动子和增强子，或者看家基因的启动子（如,gapA/GAPDH,的启动子）,如,SV40,病毒早期启动子和增强子、,Rouse,肉瘤病毒基因组长末端重复序列,LTR(RSV),、人类巨细胞病毒等,(CMV,),。,poly(A),加尾信号：,AAUAAA,真核表达载体含有两类组件：原核生物中使用的组件,(,包括复制子、抗性筛选基因和多克隆位点等,),和真核宿主细胞中表达所需的转录调控元件（,启动子、增强子、转录终止和加,poly-A,信号序列、,mRNA,剪接信号,(,内含子两侧,),序列、能在宿主细胞中复制或增殖的序列以及药物抗性基因等）,无诱导物存在时表达水平低,:,既本底表达水平低或无泄漏,诱导物存在时表达水平很高，且表达水平易受诱导物控制,启动子系统不干扰宿主细胞的正常生理活动,系统不影响宿主中其它基因的表达，不易引起免疫识别,诱导物易进入细胞，半衰期短，不易在体内残留,理想诱导表达系统的特点,内源诱导启动子,热激启动子、金属硫蛋白启动子 等,重组诱导系统,lac,、,tet,阻遏蛋白系统,激素类诱导系统,FK506,、,RU486,诱导系统,(1),热激（诱导）启动子的机理,(2),常用的热激启动子：,4.2.1,热激启动子,热激转录因子,heat shock factor 1(HSF1),：负责热激启动子的转录,热激元件,heat shock elements(HSEs),：,HSF1,特异结合在,DNA,上的序列,热激（诱导）启动子一般含有,2,4,个热激元件和一个,TATA,区,常温下,HSF1,为单体，高温条件下变为有调节活性的三聚体，并和,HSEs,特异结合而启动转录,Drosophila,hsp70,Human,hsp70,The,soybean,heat shock promoter Gmhsp17.5-E,诱导机理的普遍性,在真核细胞中普遍存在热激系统，,HSF,保守性高，不必额外表达转录因子,基因表达快速高效,hsp70B promoter:induction ratios up to 800-fold,human hsp70B,promoter,：,induction ratios up to 8000-fold.,响应时间：数十秒数十分钟,基因表达控制方便，对宿主细胞无伤害,通过控制温度高低可实现基因表达水平的精细调节,对基因表达的时间控制和空间控制,非常适合基因疗法：腺病毒作为载体携带热激启动子控制的治疗基因 感染正常细胞和癌细胞 电磁辐射或聚焦超声波技术局部加热癌组织,(3),热激启动子的特点,一个实例：,Coupling FUS(Focused Ultrasound)with MR(magnetic resonance)temperature mapping,(A)Temperature image obtained at the end of the 3 min heat-shock,superimposed on the anatomical image with a yellow broken line surrounding the tumor.The FUS focal point was maintained at the center of temperature isocontours throughout the hyeprthermia procedure.,(B)Optical view of the skin and tumor area following heat-shock with a yellow broken line surrounding the tumor,(1),金属硫蛋白,（,metallothioneins,）,启动子,Metallothioneins,(MT),：一类富含半胱氨酸的低分子量金属结合蛋白，能帮助细胞抵抗重金属的毒性。,MT,启动子的强度受到重金属浓度的调节,The yeast copper-MT system:,组成型表达的,ace1,基因,编码金属应答转录因子,该转录因子可和铜离子或银离子结合而改变为具有转录活性的构象,Cu-ACE1,结合到金属硫蛋白启动子上启动转录。,(2),糖皮质激素诱导启动子,糖皮质激素与糖皮质激素受体（也是一种转录因子）结合，使受体结合在启动子的糖皮质激素响应元件上，从而启动转录,4.2.2,化学物质诱导启动子,甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。以,Pichia Pastoris,应用最多。表达载体中含有甲醇酵母醇氧化酶基因,1(AOX1),，在该基因的启动子,(P,AXOI,),作用下，外源基因得以诱导表达。,P,AXOI,是一个强诱导型启动子，在以葡萄糖或甘油为碳源时，表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时启动子可被诱导激活，,甲醇酵母一般先在含甘油的培养基中生长，培养至高浓度。再以甲醇为碳源，诱导表达 外源蛋白。这样可以大大提高表达产量。利用甲醇酵母表达外源性蛋白质其产量往往可达,110,克,/L,级，效率远高于其他系统,与酿酒酵母相比其翻译后的加工更接近哺乳动物细胞，不会发生超糖基化。,缺点：一般需很长时间才能达到诱导峰值水平，而甲醇是高毒性、高危险 性化工产品，使得实验操作过程中存在不小的危害性。且不宜于食品等蛋白生产,（,3,）甲醇诱导系统,lacI,基因表达的改造：可持续大量在宿主中表达，终止高拷贝的启动子的转录，减少本底表达,启动子的改造：即被宿主识别又具有阻遏蛋白结合位点（序列）,（,1,）真核宿主中的,lac,、,tet,阻遏蛋白系统,(on),阻遏蛋白的毒性,诱导物的毒性,lac:50-fold,tet:500-fold,4.2.3,重组诱导系统,lac,、,tet,阻遏蛋白系统,（,2,）,tet,、,lac,反式激活蛋白系统,(off),融合蛋白：将,Tet R,或,LacI,蛋白与反式激活蛋白相连,启动子的改造：含多个,Tet R,或,LacI,结合区（,O,区）诱导效率很高，,但细胞需长期置于含四环素或,IPTG,的培养基中培养来阻止转录，诱导时不便捷、诱导响应时间较长。,tet,transactivator gene,tTA,：由阻遏蛋白,TetR,与单纯疱疹病毒,VP16,蛋白羧基末端的一段转录激活区融合而成，,tTA,位于,调节质粒,上，其表达受人巨细胞病毒启动子,IE(P,hCMV,),的调控。,反应质粒,中含有目的基因，其上游为人巨细胞病毒的,最小启动子,(minimal CMV promoter,，,P,CMV,),，启动子上游为四环素响应元件,(tet,responsive element,，,TRE),。,TRE,包含,7,个正向重复的操纵基因,(tetO),，可以和,TetR,（或,tTA),结合。,无四环素存在时,tTA,可特异的与,TetO,序列结合，目的基因得以表达；当有四环素时,(0,1,g,m1),存在时，,tTA,与,TetO,分离，基因转录被终止。,VP16,蛋白：,可促进真核细胞的基本转录因子结合在启动子上的一种转录因子。,最小启动子：,单靠自身序列无法使转录进行的启动子，需要其他转录因子（如一些上游元件或增强子等）的帮助才能正常启动。即基本转录因子自身无法有效启动转录。,例：双质粒,Tet-off,基因表达系统,CaMV 35S minimal promoter,：,-60,-46+1,，缺少,-90区,（,3,）反,tet,、,lac-,反式激活蛋白系统,(on),通过突变,TetR,的四个氨基酸残基,(Glu,71,Lys,，,Asp,95,Asn,，,Leu,101,Ser,，,Gly,102,Asp),得到了,r-TetR,它不能识别其特异的,DNA,靶序列,(TetO),，当有强力霉素存在时，,r-TetR,才可与,TetO,结合启动转录,诱导效率较高、使用便捷、诱导响应时间短,4.2.4,重组诱导系统 （,1,）类固醇的异种运用,以四环素类药物作为调节物的调控系统的缺点：,残留于细胞中的四环素难于清除、细胞吸收不平衡,四环素自身的药物动力学性质会影响系统对基因表达快速、精确、高效的控制,类固醇（,ecdysteroid,）诱导系统在诱导物的清除,和药物动力学方面都有较大的优势,类固醇是亲脂性化合物，可快速有效的进入各种组织细胞，半衰期短，不易在体内残留，是一种较为理想的基因表达诱导物,异种类固醇,的运用不会激活宿主细胞的内源信号途径,例,1,：蜕皮激素（,ecdysone,）诱导表达系统,蜕皮激素受体蛋白,EcR,和超气孔蛋白,USP,在蜕皮激素存在时形成二聚体，其和启动子上游的蜕皮激素响应元件（,EcRE X4,）结合后启动转录,类维生素,X,受体,幕黎甾酮,/,蜕皮激素,VpEcR,：融合蛋白，包含,EcR,的,DNA,结合区和,VP16,的转录激活区,超气孔蛋白（,USP),蜕皮激素受体（,EcR),来源于昆虫，应用于哺乳动物细胞,花椰菜,35S promoter,的,49,9,区,例,2,：肾上腺（糖）皮质激素,glucocorticoid,诱导系统在植物中的应用,对于植物中的基因表达应用，该系统简单、并且无多效性（,pleiotropic effects,）,in plants.,酵母转录因子,GAL4,的,DNA,结合域,糖皮质激素受体蛋白的激素结合域,VP16,反式激活蛋白的转录激活域,糖皮质激素控制,GVG,嵌合转录因子和,DNA,的结合：无激素,GVG,构象不利于,GAL4,结合域和,UAS,结合，反之，可以结合,来源于哺乳动物细胞应用于植物细胞,诱导效率低：约,100,倍,GVG,融合体：,表达元件：,雌激素,三苯氧胺,真核细胞中一些转录因子的活性受到热激蛋白的影响，通过诱导物,(,雌激素）使转录因子由无活性形式变为有活性的形式，,雌激素的诱导：雌激素与受体蛋白结合后改变其构象，使受体蛋白与,Hsp,分离而具有转录激活作用。,RU486,：人孕酮拮抗物,（替代孕酮诱导）,hPRB891,：人孕酮受体，可和孕酮及,RU486,，,HSP90,结合,融合转录因子,GALVP,的构建：,GAL4 DNA,结合区域,+VP16,转录激活区,hPRB891,配体结合域,无,RU486,时，,GALVP,单体与,HSP90,蛋白结合，不能开启转录,加入,RU486,时，,GALVP,与其结合,脱离,HSP90,二聚化,与插入到最小启动子上游的,GAL4,响应元件结合，开启转录,例,3,：,RU486,诱导系统,（,2,）化学诱导的二聚作用,FK506,调控系统,FK506:,一种天然免疫抑制剂,FKBP12:,FK506-binding protein,，,FK1012,:FK506,的人工同源二聚体,构建两种融合蛋白：,1.GAL4 DNA,结合区域,+FKBP12,，称为,GF3,；,2.VP16,转录激活区,+FKBP12+SV40,大,T,抗原的核酸定位序列，称为,NF3V1,由于,FK1012,和,FK506,与,FKBP12,的结合存在竟争关系，可以通过添加,FK1012,来激活转录，添加,FK506,来终止转录,诱导响应时间慢：约,10h,诱导物需人工合成,诱导效率低：约,10,倍，有,GF3-GF3,和,NFEV1-NFEV1,的干扰。,即一种亲免素，可与免疫抑制剂结合的蛋白,改进的,FK506,诱导系统,构建,2,种融合蛋白：,GAL4 DNA,结合区域,+FKBP12,，称为,GF3,（定位）,；,2.VP16,转录激活区,+,亲环素,（激活转录）,1,2,添加,FK506,和环胞霉素,A,的异源二聚体,(,起连接中介作用）,噬菌体展示技术,是将外源蛋白或多肽的,DNA,序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。,5.,蛋白体外展示技术,5.1,噬菌体展示技术,5.2,细菌展示技术,5.3,酵母展示技术,5.1,噬菌体展示技术,被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。,肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过,3,轮,5,轮的“吸附,-,洗脱,-,扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。,到目前为止，已开发出了单链丝状噬菌体展示系统、,噬菌体展示系统、,T4,噬菌体展示系统等数种噬菌体展示系统。,（,1,）单链丝状噬菌体展示系统,PIII,展示系统,:,PIII,是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有,3,个,5,个拷贝,P,蛋白，其在结构上可分为,N1,、,N2,和,CT 3,个功能区域,.,P,有,2,个位点可供外源序列插入,:,信号肽,Sg,和,N1,之间，保留了完整的,P,蛋白，噬菌体仍有感染性；,直接与,P,蛋白的,CT,结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整,P,蛋白来提供。,P,及其他展示系统：,P,是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，,C,端与,DNA,结合，,N,端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有,2 700,个左右,P,拷贝。,P,的,N,端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。,有辅助噬菌体参与时，可提供野生型,P,蛋白，降低价数，此时可融合较大大多肽甚至抗体片段。,（,2),噬菌体展示系统,PV,展示系统,:PV,蛋白组装成尾部管状部分（,32,个盘状结构，每个盘由,6,个,PV,亚基组成）。,PV,的,C,端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。,PV,系统已成功展示了有活性的大分子蛋白,-,半乳糖苷酶（,465 kD,）和植物外源凝血素,BPA,（,120 kD,）等。,噬菌体在在胞内装配，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。但该系统展示的数目为平均,1,个分子,/,噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了,噬菌体的尾部装配。,D,蛋白展示系统,：,D,蛋白封闭,噬菌体头部，可作为外源序列融合的载体，该系统优点：,D,蛋白呈突出状分布，利于融合蛋白和配体结合。可以同时提供野生型,D,蛋白和融合,D,蛋白，通过控制两者表达强度来调节比例，达到单价展示的效果。这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。,（,3,）,T4,噬菌体展示系统,T4,噬菌体展示系统是,20,世纪,90,年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将,两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质,，分别与,T4,衣壳表面上的外壳蛋白,SOC,（,9 kD,）和,HOC,（,40 kD,）融合而直接展示于,T4,噬菌体的表面。,T4,噬菌体是,在宿主细胞内装配,，不需通过分泌途径，因而可,展示各种大小,的多肽或蛋白质，很少受到限制。,SOC,与,HOC,蛋白的存在与否，并不影响,T4,的生存和繁殖。,SOC,和,HOC,在噬菌体组装时可优于,DNA,的包装而装配于衣壳的表面，事实上，在,DNA,包装被抑制时，,T4,是双链,DNA,噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体（SOC,和,HOC,也同时组装）。因此，在用重组,T4,做疫苗时，它,能在空衣壳表面展示目的抗原,，这种缺乏,DNA,的空衣壳,疫苗,，在生物安全性方面具有十分光明的前景。,该系统和,噬菌体系统均可以体外包装实现展示，因此，可用于构建人工多酶体系（比如一条途径中的多个酶展示于同一个病毒表面），多功能疫苗（多种抗原决定簇展示于同一病毒表面），超级酶（一个病毒展示数百上千个酶分子）,噬菌体展示技术的局限性,在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就大大限制了所建库的容量和分子多样性。目前，常用的噬菌体展示文库中含有不同序列分子的数量一般限制在,10,9不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合。由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,5.2,细菌展示技术,细菌表面展示技术,是利用基因工程手段将某一蛋白质或短肽段,(,靶蛋白,),与原核微生物外膜蛋白,、,脂蛋白、表面附属结构亚单位如鞭毛、菌毛,以融合蛋白的形式呈现在细胞表面。,外源蛋白与载体蛋白序列融合方式有,C,端融合、,N,端融合和夹心融合。,C,端融合：,如脂蛋白一外膜蛋白,A(Lpp-OmpA,嵌合体,),系统其,OmpA,的,N,端锚定在外膜；,N,端融合：,如免疫球蛋白,A,蛋白酶家族中的一些成员含有自动转运结构，其,C,端锚定在细胞外膜，适于,N,端融合；,夹心融合,：如麦芽糖孔蛋白,(Lamb),本身具有信号肽序列及锚定于外膜的序列，在其内部合适位点插入外源蛋白，可实现细胞表面展示。,与,G,一,相比，,G,+,表面展示系统有相同或类似的表面锚定机制，允许大片段外源蛋白插入。,G,+,所展示的蛋白只需通过单个质膜层，而,G,一,展示蛋白不仅要通过质膜层还要在外膜上正确整合，这对展示蛋白的结构和活性可能产生影响。,G,+,细胞壁较厚，因而更坚固,造成膜蛋白不易暴露。,一些,G,+,如枯草杆菌分泌大量蛋白酶，给应用带来困难。,常用的表面展