第八章基因与疾病.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 基因与人类疾病,本章主要内容,1、肿瘤与癌症,2、艾滋病,3、乙肝,4、非典,5、基因诊断,6、基因治疗,人类基因病症三大类：,1、经典单基因病,2、多基因病,3、获得性基因病,第八讲疾病与人类健康,经典单基因病。至今已发现6，000余种，其主要病因是某个基因位点上产生了缺陷等位基因。,多基因病。这些病的发生涉及多个基因及调控这些基因表达的环境因子之间的相互作用。大多数人类疾病，特别是危害较大的高血压、糖尿病、骨质疏松、精神及神经病等，都属于这一范畴。,获得性（acquired）基因病,。,主要是由病原微生物感染引起的传染病，虽然不符合经典的世代遗传方式，但基本是病原微生物基因组与人类基因组相互作用的结果，都涉及基因结构与表达模式的改变。,流行病学资料,1775年，伦敦医生Percival Pott发现，早年曾干过扫烟囱活计的男人易患阴囊癌,19世纪早期，人类的平均寿命只有35岁，而癌症特别喜欢光顾老年人，所以直到19世纪癌症一直是一种相对罕见的疾病。,自20世纪50年代起，吸烟人群的肺癌是非吸烟人群的20-30倍。,20世纪初，与X射线打交道的人易患皮肤癌和白血病。为夜光表涂抹镭的女工由于常常舔刷毛而易患舌癌。,癌症的地方特征：非洲某地的肝癌18倍于英国，日本的胃癌11倍于美国，美国的结肠癌10-20倍于非洲某地。当人们从世界的一地移居于另一地时，他们的下一代呈现新居地癌症的典型特征,培养时间(天),正常细胞,+血清生长因子,癌细胞,-血清生长因子,正常细胞,-血清生长因子,癌细胞,+血清生长因子,细胞数量,癌基因（oncogene）可分为两大类：,一类是病毒癌基因（viral oncogene，V-onc）编码病毒癌基因的主要有DNA病毒和RNA病毒。,DNA病毒包括乙型肝炎病毒、SV40和多瘤病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒和痘病毒。,RNA病毒主要是,反转录病毒,。反转录病毒致癌基因（retrovirus onc）可能是研究最多的病毒基因，它们能使靶细胞发生恶性转化。,第二类是,细胞转化基因(C-onc)它们能使正常细胞转化为肿瘤细胞，这类基因与病毒癌基因有显著的序列相似性。,8.1.1反转录病毒致癌基因,Rous在1910年发现带有单链RNA肉瘤病毒（一种反转录病毒）鸡肉瘤无细胞滤液能在鸡体内诱发新的肉瘤。,反转录病毒,这种病毒的基因组只有6-9kb。RNA上的基因数目很少，它们被包裹在由gag和env两个基因编码的蛋白质外壳中，其中env基因指导外壳蛋白的合成，gag基因则指导,“,鞘,”,蛋白的合成，这些,“,鞘,”,蛋白好像,“,道钉,”,一样,“,箍,”,在外壳的表面，维持外壳蛋白结构的稳定性。,该反转录酶再以病毒,RNA,为模板，转录出单链DNA,分子，利用宿主,DNA,聚合酶指导合成第二条,DNA,链，以双链,DNA,形式整合到宿主细胞基因组中。,被整合的反转录病毒,DNA,分子称为,原病毒,（,provirus,），它能指导病毒,mRNA,的合成，并利用宿主细胞中的蛋白质合成机器，翻译生成病毒外壳蛋白等，最后组装成病毒颗粒。,图,8-4,反转录病毒插入引起,C-myc,基因活化的几种可能途径,肉瘤病毒,V-Src,基因，编码有,514,个氨基酸的,p60Src,磷酸化蛋白，其,C,端,250,个氨基酸是活性区域，负责将磷酸基团转移到酪氨酸残基上。它的作用主要是使多个靶蛋白发生磷酸化，从而影响它们的功能，加速细胞癌变的过程。科学家发现，一种存在于细胞基部质膜附着点内被称为,枢纽蛋白,（,vinculin,）的细胞骨架蛋白的磷酸化可能是引起细胞癌变的中心环节。,质膜附着点的主要作用是通过细胞膜固着蛋白，将细胞固定在所处的表面，肌动蛋白纤丝也依附在上面。位于附着点内的枢纽蛋白则起着连接肌动蛋白纤丝束和细胞膜固着蛋白的作用。,正常情况下，该蛋白上的酪氨酸残基只有轻度的磷酸化。,转化细胞中，由于,p60Src,结合在附着点内靠近或位于枢纽蛋白处，使这一蛋白的磷酸化水平提高了,20,倍以上，明显降低了枢纽蛋白连接肌动蛋白纤丝束和细胞膜固着蛋白的功能，导致肌动蛋白纤丝束松散，细胞粘附能力减弱，容易发生脱落和转移。,V-onc,基因的起源,研究发现，反转录病毒基因组中所带有的,onc,基因并非来自病毒本身，而是这些病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。,动物或人原癌基因经病毒修饰和改造后，成为病毒基因组的一部分并具有了致癌性，其作用的靶分子也往往发生改变。,图,8-5,劳斯氏肉瘤病毒基因结构及,C-Src,原癌基因的转变。,实验表明，在肿瘤细胞中，“生长控制点”不起作用，所以瘤细胞一直处于细胞周期循环之中。,图8-6 上表皮癌的发生过程示意图,8.1.2 原癌基因产物及其分类,除了病毒感染外，许多非病毒因子（如放射性物质、化学试剂亚硝酸、烷化剂等）也能诱导细胞转化。这些因子并没有把致癌基因或其他致癌的遗传信息带入细胞，而仅仅通过某种激活机制改变了细胞内原有的遗传信息(内源基因发生突变)，使细胞发生恶性转化。,8.1.3 原癌基因的表达调控,原癌基因在正常细胞中通常以单拷贝形式存在，只有低水平的表达或根本不表达。在很多情况下，原癌基因的结构发生了点突变或插入、重排、缺失及扩增等，改变其转录活性。,图,8-8,细胞中原癌基因转变为癌基因的主要途径,细胞癌基因的激活,细胞癌基因的激活是指原本不致癌c-onc在特定的情况下转变成致癌性的，大体上有以下几种激活方式。,A、突变激活典型的是各种ras基因的激活,第61位谷氨酰胺被亮氨酸,ras基因的表达产物Ras是一种小分子G蛋白，在信号转导中起重要作用，正常Ras的作用因其自身的GTP酶活性而受到严格控制，而突变了的Ras其GTP酶活性下降或丧失，失去了原有控制，致使增殖信号持续作用，细胞发生恶性转化,B.LTR,插入。,LTR,是逆转录病毒基因组两端的长末端重复序列（,long terminal repeat,），含有强启动子序列，当,LTR,插入原癌基因启动子区域或邻近部位后，可从根本上改变基因的正常调控规律。,LTR,插入到,c-myc 5,上游启动子附近，使,c-myc,的转录水平大大增加。,C、基因重排/染色体易位,典型的如伯基特淋巴瘤细胞的染色体易位t（8：14），致使c-myc激活,图,8-10 abl,原癌基因通过选择性,染色体重排转变成细胞癌基因,D.,缺失。,很多原癌基因,5,上游区存在,负调控序列,，一旦该序列发生缺失或突变，就丧失抑制基因表达调控的能力。如,Burkitt,淋巴瘤中,C-myc,可因负调控序列的缺失或,LTR,插入破坏其结构而增强表达,E.,基因扩增。使每个细胞中基因拷贝数增加，从而直接增加可用的转录模板。,不同的癌基因有不同的激活方式，一种癌基因也可有几种激活方式。例如c-myc的激活就有基因扩增和基因重排两种方式，很少见c-myc的突变；而ras的激活方式则主要是突变，细胞转化实验证明，各种癌基因之间存在协同作用。,Weingerg,按转染细胞表型的变化将癌基因分为两个类，一类是核内作用的能使细胞永生化的癌基因，例如myc，fos等，另一类是引起细胞恶性表型变化的定位于质膜和胞浆的癌基因，例如ras、erbB、src等。事实表明肿瘤的发生是多步骤，多因素的，不同的癌基因作用于肿瘤发生的不同阶段。,8.1.4 基因互作与癌基因表达,1.,染色体构象对原癌基因表达的影响。,基因表达不仅取决于基因本身及其相邻区域的,一级结构,，也取决于其,空间构象,，即基因在染色体上的空间排列和染色质的结构。当,两个基因相距,太近时，往往不易形成有利于高效转录的空间结构。,基因与基因之间的间隔距离被定义为,“,基因领域”（gene territory,）。同一,DNA,链上两个具有相同转录方向的基因间隔小于一定长度时，影响有效转录所必需的染色质结构的形成，从而使这两个基因中的一个或两个均不能转录或转录活性显著降低，产生所谓,基因领域效应,（,gene territorial effect,）。,正常人,c-myc,定位于第,8,号染色体，在其两侧分别存在强表达的基因，使,c-myc,处于两面受夹击的地位。在,Burkitt,淋巴瘤中，由于发生基因重排，使,c-myc,基因一侧的强表达基因消失，从而消除了对,c-myc,的基因领域效应，使后者的转录活性增强。,小鼠细胞中，c-myc的5上游区域也存在一个强表达基因，全长15kb，距c-myc只有3kb。很显然，这一间隔距离太短，与基因有效转录应有的最小距离相差甚远，c-myc受基因领域效应的影响非常大，表达受抑制。,在小鼠乳腺癌细胞中，上述间隔距离被显著拉长，激活c-myc转录。,2.,原癌基因终产物对基因表达的影响。,癌基因产物通过介质传递生长刺激信号的部位有,3,处：,癌基因产物本身模拟了生长因子，因而与相应的受体作用，以自分泌的方式刺激细胞生长；,癌基因产物模拟了已结合配体的生长因子受体，从而在无外源生长因子时提供了促进细胞分裂的信号；,癌基因产物作用于细胞内生长控制途径，解除此途径对外源刺激信号的需求。,人血小板衍生生长因子（PDGF）与猴肉瘤病毒（SSV）的V-ras癌基因产物，上皮生长因子（EGF）与Src及V-erb癌基因产物之间都存在着极高的相似性，表明生长因子与癌基因转化有关。,3.,抑癌基因产物对原癌基因的调控。因为抑癌基因产物能够抑制细胞的恶性增殖，所以它被认为是一种隐性癌基因。当细胞内由于某种原因造成这些基因的表达受抑制时，原癌基因就活跃表达，引起细胞癌变。,p53基因，Guardian of the genome.,1990年，科学家首次发现p53是一个肿瘤抑制基因。缺失该基因时，患Li-Fraumeni Syndrome。此外，病人极易患乳腺癌，脑癌和白血病。,p53,基因在星形细胞癌、乳癌、肺癌、肠癌及骨肉瘤中都有高频率缺失现象。从癌细胞中得到的,p53,基因，其保守序列区有单一位点的突变，推测可能由于这一突变导致,p53,基因产物结构与功能的改变，失去抑癌活性。,p53基因与细胞癌变,a.正常情况下，细胞分裂与p53基因无关；,b.如果细胞中的受损伤，p53基因被激活，使细胞受阻于G,1,阶段直到被修复或启动细胞凋亡程序；,c.如果细胞中p53基因的两个拷贝同时被破坏，细胞可能直接死于有丝分裂过程中，也可能带着损伤继续分裂，从而导致发生恶性肿瘤。,Rb,基因是从视网膜纤维瘤中克隆到的另一个抑癌基因，,其功能是阻止处于,G,0,/G,1,期的细胞进入,S,期，从而控制细胞增殖。正常,Rb,基因的表达几乎可抑制所有培养细胞的分裂。,Rb,克隆到的另一个抑癌基因,Rb基因的突变失活不仅导致视网膜神经胶质瘤,在多种癌症中也发现了它的踪影：骨肉瘤、前列腺癌、软组织肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、食道癌,4.,外源信号对原癌基因表达的影响,细胞外信号（包括生长因子、激素、神经递质、药物等）作用于靶细胞后，通过细胞膜受体系统或其它直接途径被传递至细胞内，再通过多种蛋白激酶的活化，对转录因子进行修饰，然后激活一系列基因转录。,图,8-11,许多原癌基因参与细胞信号转导过程,根据原癌基因产物在细胞中的位置可分为,3,类。,与膜结合的蛋白：如,erbB,、,neu,、,fms,、,mas,和,src,；,可溶性蛋白：如,mos,、,sis,和,fps,；,核蛋白：如,myc,、,ets,jun,和,myb,等。,根据这些蛋白的功能，它们又常被分为6个功能群类别,蛋白激酶类、,生长因子类、,生长因子受体类，,GTP,结合蛋白类、,核蛋白类,和功能未知类,8.4 基因治疗,人类疾病的发生，其实都是人体细胞中自身基因的改变或由外源病原体的基因产物与人体基因相互作用的结果。,8.4.1,基因治疗的历史沿革,1990年，科学家第一次用反转录病毒为载体把腺苷脱氨酶基因（,ADA,）导入来自病人自身的T淋巴细胞，经扩增后输回患者体内，获得了成功。5年后，患者体内10%的造血细胞呈ADA基因阳性。,基因治疗的两大途径,ex vivo,与,in vivo,方式。,ex vivo,途径,将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体（异种）被,“,基因工程化的,”,细胞，经体外细胞扩增后输回人体。,这种方法易于操作，而且因为细胞扩增过程中对外源添加物质的大量稀释，不容易产生副作用。同时，治疗中用的是人体细胞，尤其是自体细胞，安全性好。,in vivo,途径,将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体上，直接导入人体内。,这种载体可以是病毒型或非病毒型，甚至是裸,DNA,，有利于大规模工业化生产。,这种方式导入的治疗基因以及其载体必须证明其安全性，而且导入体内之后必须能进入靶细胞，有效地表达并达到治疗目的。,8.4.2,基因治疗中的病毒载体,用于基因治疗的,病毒载体,应具备以下基本条件：,携带外源基因并能装配成病毒颗粒；,介导外源基因的转移和表达；,对机体没有致病力。,1、病毒载体的产生,将适当长度的外源,DNA,插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。,将,4.5kb,的,lacZ,基因表达盒插入,HSV-1,病毒的,UL44,（编码糖蛋白,C,）基因的,Xba I,位点中，构建成重组,HSV,病毒。由于,UL44,基因产物对于,HSV,病毒在培养细胞中产毒性感染是非必需的，该重组病毒可以在细胞中增殖传代。,2、重组型病毒载体,在不改变病毒复制和包装所需的顺式作用元件的情况下，有选择性地删除病毒的某些必需基因尤其是前早期或早期基因以控制其表达，所缺失的必需基因的功能由同时导入细胞中的外源基因表达单位提供。一般通过同源重组方法将目的基因插入到病毒基因组中。,3、无病毒基因的病毒载体,在辅助系统的作用下，重组载体以特定形式（单链或双链,DNA,或,RNA,）被包装到不含有任何病毒基因的病毒颗粒中。这类载体的优点在于载体病毒本身安全性好，容量大。缺点在于往往需要辅助病毒参与载体,DNA,的包装，造成终产品中辅助病毒污染。,4,、基因治疗中的问题,基因导入系统,基因表达的可控性,需要更多的治疗基因,1,）基因导入系统。,基因治疗中的关键问题是必须将治疗基因送入特定的靶细胞，并在该细胞中得到高效表达。这对于恶性肿瘤治疗尤为重要，如果不能有效地将治疗基因导入大多数肿瘤细胞，则至少要求它尽可能不进入或较少进入正常细胞。,2）外源基因表达的可控性。,最理想的可控性,是模拟人体内基因本身的调控形式，需要全基因或包括上下游的调控区及内含子序列，将对导入基因的载体系统产生严峻的挑战，因为今后设计的载体须有几十,kb,甚至上百,kb,的包装能力。,在目的基因上游区接上,gal 4,的顺式元件，用带有疱疹病毒,VP16/gal 4 DNA,结合区的孕酮受体的变异体作为激活蛋白。,该变异体（,PR-LBD,）只能与孕酮的颉抗剂（,RU486,）相结合而不与孕酮或其他衍生物结合。当体系中不存在,RU486,时，治疗基因的表达水平极低；而给予,RU486,后，,RU486,与,PR-LBD,结合，激活,VP16,，杂种激活蛋白形成二体并通过,gal 4 DNA,结合区与治疗基因上游区的,gal 4,顺式元件结合，启动治疗基因的表达。,图8-26 导入基因的,表达诱导框架图。,3）治疗基因过少,目前用于临床试验的治疗基因数量很少。绝大部分多基因疾病，如恶性肿瘤、高血压、糖尿病、冠心病、神经退行性疾病的致病基因还有待阐明，因此，可选择的靶基因不多。,非病毒载体,非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是裸DNA、,脂质体、阳离子多聚物型载体,，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景,作业思考题,名词：,癌基因，抑癌基因，细胞原癌基因,简答：,细胞原癌基因激活引起癌症发生的途径？,5、基因诊断,基因诊断的对象,1、病原生物的侵入:直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。而肝在无法得到商业化抗体时，基因诊断就成为检测病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段。诊断的特异性也大为提高。,2、先天遗传性疾患：已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。用基因诊断的方法检测这些位点的改变，不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机理的研究都具有重要的意义,3、后天基因突变引起的疾病：这方面最典型的例子就是肿瘤。,4、其它：如DNA指纹、个体识别，亲子关系识别，法医物证等。,基因诊断的方法,从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断1、核酸杂交：,酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为DNA印迹交和RNA印迹杂交。其基本过程包括下列几个步骤。,制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。,制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。,杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。,检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。,2、聚合酶链反应,用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量，达到提高敏感性的目的。,耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）,以爱滋病的临床检测为例，简要说明一下PCR在病毒感染的基因诊断中的应用。,组织中总RNA的提取,利用反转录酶合成cDNA,PCR反应：,反应液组成：反应缓冲液,模板（上述合成的cDNA）,底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）,引物（爱滋病病毒特异性引物）,TaqDNA聚合酶,50l,循环：95，30sec（变性）,55，1min（退火）30循环,72，1min（聚合）,检测：电泳或核酸杂交,6、基因治疗,（一）基因治疗的概念和策略,基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，他们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。,目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为,基因治疗,。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：,基因治疗策略,基因置换（gene replacement）：基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。,基因修复（gene correction）：基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。,基因修饰（gene augmentation）又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止冠状动脉诱发的血栓形成。,基因失活（gene inactivation）：利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。,免疫调节（immune adjustment）：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。,其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损伤。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性GCV药物，由于只有含HSV-TK基因的细胞才能将GCV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。,一些常见疾病的治疗策略隐性遗传病,-用正常基因置换致病基因而达到完全校正,-导入正常基因序列以达到暂时性校正,显性遗传病,-用正常基因置换致病基因而达到完全校正,-使有害基因失活而达到暂时性校正,-在某些情况下可导入正常基因加以校正,基因治疗策略,肿瘤,-杀伤肿瘤细胞（如利用自杀基因，激活免疫系统及保护正常细胞免受化疗药物的损伤等）,-使癌基因失活（反义技术、核酶）或增加抑癌基因的表达,传染病,-杀伤传染源（免疫法、自杀基因）,-使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井）,其它疾病,-导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子,-失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井）,-杀伤策略如减少特异细胞群,基因治疗的基本程序,（1）目的基因的选择和制备,（2）基因的转运,（3）靶细胞的选择,（4）细胞转染,（5）外源基因的表达及检测,(二)基因治疗的基本程序,（1）目的基因的选择和制备：,可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。,在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA，也可是基因组DNA片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备,（2）基因的转运,目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。,病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒、疱疹病毒和肝炎病毒等。,逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：,A：将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因,B：制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能,C：将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。,D：病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达,非病毒载体,非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是裸DNA、,脂质体、阳离子多聚物型载体,，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景,（3）靶细胞的选择,理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用,体细胞,，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。,（4）细胞转染（tansfection）,将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中介绍。目前较多使用的是脂质体法,（5）外源基因的表达及检测,在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，,免疫组织化学染色,等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则,是检测外源基因翻译出的蛋白质,。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。,三、基因治疗中问题,1、靶向性基因导入系统,2、外源基因表达的可控性,3、治疗基因过少,