腊样芽孢杆菌.ppt

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,1,、形态特性,蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性大杆菌，大小为,1-1.33-5m,，兼性需氧，形成芽胞，芽胞不突,出菌体，菌体两端较平整多数呈链状排列，与,炭疽杆菌相似。引起食物中毒的菌株多为周鞭毛，,有动力。,一、生物学特性,电镜下的腊样芽孢杆菌,用孔雀绿染色的蜡样芽孢杆菌芽孢,荧光染色的铜绿假单胞杆菌和蜡样芽孢杆菌,血琼脂平板,甘露醇卵黄多粘菌素平板,2,、培养特性,3,、耐热性,蜡杆芽胞杆菌耐热，其,3716,小时的肉汤培养物的,D80,值（在,80,时使细菌数减少,90%,所需的时间）约为,10-15,分钟；使肉汤中细菌（,2.4107/mL,）转为阴性需,10020,分钟。其游离芽胞能耐受,10030,分钟，而干热灭菌需,12060,分钟才能杀死。,二、流行病学,1,、细菌分布,蜡样芽胞杆菌在自然界分布广泛，常存在于土壤、灰尘和污水中，植物和许多生熟食品,中常见。已从多种食品中分离出该菌，包括肉、,乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、,炒米饭以及各种甜点等。,在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐,型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、,肉饼、色拉和奶、肉类食品引起；在我国主要,与受污染的米饭或淀粉类制品有关。,2,、流行情况,蜡样芽胞杆菌作为一种食源性疾病的报导较多，在各种食品中的检出率也较高，如,1982,年犬饲等对日本名古屋所采,1641,份食品样品中，有,193,份检出了该菌、阳性率为,11.8%,；,1984,年我国有关单位对南京市所采,211,份食品样品中，有,81,份检出了该菌，阳性率为,38.4%,。,蜡样芽胞杆菌食物中毒通常以夏秋季（,6-10,月）最高。引起中毒的食品常于食前由于保存温度不当，放置时间较长或食品经加热而残存的芽胞以生长繁殖的条件，因而导致中毒。中毒的发病率较高，一般为,60-100%,。但也有在可疑食品中找不到蜡样芽胞杆菌而引起食物中毒的情况，一般认为是由于蜡杆芽胞杆菌产生的热稳定毒素所致。,1985,年,9,月，美国缅因州的健康局报导了在一家日本餐馆发生了食物中毒而导致的胃肠炎事件，经调查所有的食品其加工和储藏都是规范的，仅用剩饭制作的炒饭其是冷藏储放还是在室温放置说不清楚，在炒饭中虽然找不到活的蜡样芽胞杆菌，但是完全可能存在重新加热过程中消除了活菌而没有破坏热稳定毒素的可能性。,三、致病性,蜡样芽胞杆菌引起食物中毒是由于该菌产生,肠毒素。它产生两种性质不同的代谢物，引起,腹泻型综合症的是一种大分子量蛋白；而引起,呕吐型综合症的被认为是一种小分子量、热稳,定的多肽。,致呕吐型综合症的肠毒素至今尚未提纯，,致腹泻型综合症的肠毒素已提纯，其纯化的,肠毒素分子量为,55-6.010,3,。致腹泻的肠毒,素能使小白鼠致死。,四、国标检验,1.设备和材料,1.1 冰箱：0-4,1.2 恒温培养箱：36 士1,1.3 恒温水浴锅,：,46 士1,1.4 显微镜：10X-100 X.,1.5 均质器或灭菌乳钵,1.6 架盘药物天平：0 g-500 g精确至0.5 g,1.7 灭菌锥形瓶：500 mL.,1.8 灭菌试管：16 mm X 160 mm,1.9 灭菌吸管：1ml（具0.01 mL刻度）,10 ml（具0.1ml,，刻度）,1.10 灭菌平培养皿：直径90 mm,1.11 灭菌刀、剪,、镊子等,2.,培养基和试剂,2.,1,.,肉浸液肉汤培养基,2.,2,.,酪蛋白琼脂培养基,2.,3,.,动力,-,硝酸盐培养基,2.,4,.缓冲葡萄糖蛋白,胨水,2.,5,.,血琼脂培养基,2.,6,.,3 过氧化氢溶液,2.,7,.,甲,萘,胺,-,乙酸溶液,2.,8,.,对氨基苯磺酸,-,乙酸溶液,2.,9,.,革兰氏染色液,2.,10,甘露醇卵黄多粘菌素（MYP)琼脂培养基,2.,11,.,0.5碱性复红染色液,2.,12.,木糖,-,明胶培养基,3.,蜡样芽胞杆菌检验程序,4.1 菌数测定,以无菌操作将检样25g(m1),，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液,做成,10,-1,-10,-5,的稀释液按GB/T4789.2测定,。取各稀释液。,0.1mL，,接种在两个选择性培养基-甘露醇卵黄多粘菌素(MYP)琼脂培养基上，,用L形棒涂布于整个表面，置3 6 士1 培养12h-20h,，选取适,当菌落数的平板进行计数，,蜡样芽胞杆菌在此培养幕上的菌落为粉,红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶,）,。计数后，从中挑取五个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽,胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，,即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如：将0.1m1,的,10,4,样,品稀释液涂布于,MYP平板土，其可疑菌落为2 5个，取五个鉴定，,证实四个菌落为蜡样芽胞杆菌，则1g(ML）检样中所含蜡样芽,胞杆菌数为：,2 5 X 4/5 X10,4,X102X10,6,4.,操作步骤,4.3,证实试验,4.3.1,形态观察,本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在,1um,或,1um,以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。,4.2,分离培养,取检样或稀释液划线分离于选择性培养基（,MYP),上置,37,培养,12h-20h,，挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌,落（见,6.1),接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，,然后做证实试验。,4.3.2,培养特性,本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上其菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐。,4.3.3,生化性状及生化分型,4.3.3.1,生化性状,本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液,化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。,4.3.3.2,生化分型,根据蜡样芽胞杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、,V-P,反应、明胶液化性状的试验，分成不同型别，见表下表,.,4.3.4,与类似菌鉴别,本菌在生化性状上与苏云菌芽胞杆菌极为相似,但后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下,:,取营养琼脂上纯培养物少许,加少量蒸馏水涂于玻片上,待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上,半分钟后倾去甲醉,置火焰上干燥，然后滴加,0.5,碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸气维持,l.5min,，移去酒精灯,将玻片放置半分钟，倾去染液,置洁净自来水充分漂洗、晾干、镜检。在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体（如未形成游离芽胞，培养物应放室温再保存,1d-2d,后检查）如有即为苏云金芽胞杆菌,蜡样芽胞杆菌检查为阴性。,Thank You!,Thank You!,