E-玫瑰花结实验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验内容,E-,花环形成试验（同学操作）,一、外周血单个核细胞的分离,细胞来源：人外周血,分离的方法：聚蔗糖泛影葡胺密度梯度离心法,（,2,）离心后小心取出，可见管中的液体分以下三层，用尖头滴管吸出上下两层液体之间呈灰白色的单个核细胞层，移入另一试管中，用适量（约,10ml,）,1640,细胞培养液混匀。,淋巴细胞分离液,血浆、血小板、,Hanks,液,红细胞,单个核细胞,多形核白细胞,1,、人外周血单个核细胞（,PMBC,）的分离,（,1,）,抗凝血,3ml+1640,细胞培养液,3ml,（倾倒法混匀），用吸管吸取上述稀释后的细胞悬液（,6ml,），,小心,叠加,于淋巴细胞分离液（,3ml,）上。注意保持两者分界面清晰！,平衡后即离心（,2500rpm,，,20min,）,实验流程,肝素抗凝血及,Hanks,液,淋巴细胞分离液,2,淋巴细胞计数,方法,PBMC,悬液,0.1ml+0.9ml 0.5-1%,冰醋酸，混匀后滴加,1,滴 液体于细胞计数板上，在低倍镜下计数四大格单个核细胞总和。,计数原则,a.,偶见两个以上组成细胞团按单个细胞计算,b,压线细胞计左不计右，计上不计下,计数结果：,（四大格细胞数和25000,即待测细胞悬液的浓度（单位,ml),注意事项：,i.,注入细胞板上的细胞悬液量要适量，不理想者重试,.,ii.,计数后计数板立即浸入水，以防细胞悬液变干；低倍镜镜头回收,E-,花结形成试验,原理,人外周血,T,淋巴细胞上能与绵羊红细胞结合的受体，称为,E,受体，即,CD2,分子或,LFA-2,（淋巴细胞功能相关抗原,-2,）；在一定的试验条件下，绵羊红细胞能与该受体结合形成以,T,细胞为中心，四周绕以绵羊红细胞的玫瑰花团，故称,E,花环形成试验。,花结,花结分类：,Ea-RFC(,效应,T,细胞,),：正常值为,1535%,。,E-RFC(,总和,),：正常值为,6080%,。意义：,E-,受体为,T,细胞所特有，是鉴定,T,细胞的重要标志之一，还用于,T,细胞的分离。,用于检测患者外周血中,T,细胞的比例及数目，间接反映患者细胞免疫功能。,3 E-,花环形成,将计数后的细胞悬液用,Hanks,液配成,110,6,/ml,，将剩下的约,0.9ml,细胞悬液，离心（,2000rpm,，,10min,）后弃上清，留约,0.1ml,压积细胞。,用,0.1ml,预先经,SRBC,吸收的,10%,小牛血清将上述压积细胞搓捻重新悬浮，而后加入,0.2ml 1%SRBC,，轻轻摇匀，,37,预温,5min,后离心（,500-1000rpm,，,5min,），,4,冰箱中放置,15h,。,4,固定、染色、镜检,固定：取出孵育后的细胞，吸弃部分上清，留约,0.1-0.2ml,，轻轻旋转、搓捻使细胞悬浮，滴加,0.8%,戊二醛,0.1ml,，混匀，,4,冰箱中放置,15min,。,涂片：取出上述细胞悬液后，再轻轻旋转、搓捻混匀，推厚血片。,干燥：自然凉干。,瑞士干片染色：,滴,35,滴瑞士染液，至盖满整个血片为止。,约,40,秒后，加,23,倍蒸馏水，用洗耳球混匀。,约,3,min,后，用细流水冲洗，吸水纸吸干，,油镜下观察结果。,200,n,E-RFC,100%,E,花结形成细胞百分率,=,镜检：计数,200,个淋巴细胞，周围粘附,3,个或,3,个以上,SRBC,的淋巴细胞为,E,花结形成细胞（即,T,细胞）。,*注意事项：,油镜使用后用擦镜纸拭干镜头，摆开物镜，收箱。,实验材料分配：（,2,人,/,组）,肝素管及淋巴细胞分离管,1,支,/1,组,细胞计数板,1,块,/2,组,Hanks,液,1,瓶,/,列,0.8%,戊二醇,1,瓶,/,班,1%,冰醋酸,1,瓶,/,班,绵羊红细胞,3,瓶,/,班,流式细胞仪的细胞分析原理,实验报告,E-,花结形成试验的原理、简要步骤、结果及其讨论。,T,淋巴细胞转化实验,原理,淋巴细胞表面有有丝分裂原的受体。其中，,PHA,、,ConA,的受体为,T,淋巴细胞所特有。当,T,淋巴细胞在体外培养时，加入,PHA,或,ConA,使其受到刺激，,T,淋巴细胞能转化为淋巴母细胞，同时伴有,DNA,、,RNA,及蛋白质合成的增加，最终导致细胞分裂。根据其转化率可测定,T,淋巴细胞的功能，从而反映机体的细胞免疫功能。,形态学方法,同位素法,MTT,比色法,MTT,即甲基四氮唑蓝，呈黄色。活细胞内线粒体脱氢酶能将它还原为蓝色结晶状甲,Zan,，甲,Zan,可溶于有机溶剂（盐酸异丙醇、二甲基亚砜或无水乙醇等），溶解后进行比色测定。甲,Zan,生成量（即颜色深浅）可反映细胞代谢活性强弱。正常细胞转化率为,5070%,。,淋转,基本,方法,PHA,活细胞内线粒体脱氢酶 有机溶剂溶解,甲基四氮唑盐（,MTT,；黄色）甲,Zan,（蓝色结晶）,甲,Zan,生成量（即颜色深浅）可反映细胞代谢活性强弱；,正常细胞转化率为,5070%,。,MTT,原理,