tl2-DNA复制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,逆转录：,（,RNA,指导的,DNA,合成)是,RNA,病毒的复制形式，以,RNA,为模板，由逆转录酶催化合成,DNA,。这种,RNA,病毒又叫逆转录病毒。,修复合成：,DNA,受到损伤（突变）后进行修复，需要进行局部,DNA,的合成，用以保证遗传信息的稳定遗传,。,DNA,生物合成,DNA,复制:,（,DNA,指导的,DNA,合成）是细胞内最主要的合成方式。遗传信息储存在,DNA,分子中，细胞增殖时，,DNA,通过复制是遗传信息从亲代传递到子代。,子代,DNA,复制,(,Replication,),是指遗传物质的传代，以母链,DNA,为模板,合成子链,DNA,的过程。,复制,亲代,DNA,分子基础：碱基配对规律 和,DNA,双螺旋结构,化学本质：生物细胞内酶促的单核苷酸聚合,全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,简称：,DNA-pol,活性特点,：,1.,以,DNA,为模板,2.,以,dNTP,为原料,3.,以碱基互补为指导原则,4.,催化形成,3,，5,-磷酸二脂键,5.,不能催化游离的脱氧核苷栓聚合,6.,外切核酸酶活性,DNA,聚合酶,半保留性,双向性,半不连续性,DNA,复制的特征,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式,半保留式,混合式,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA,生物合成时，亲代,DNA,双螺旋结构解开，分别以解开的,两股单链作为模板,(,Template,)，,以,dNTP,为原料,，,按,碱基互补原则,，合成与模板互补的子链。子代细胞的,DNA,，,一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全重新合成。两个子细胞的,DNA,都和亲代,DNA,碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,半保留复制的概念,半保留复制的意义,按半保留复制方式，子代,DNA,与亲代,DNA,的碱基序列一致，即,子代保留了亲代的全部遗传信息,，体现了遗传的保守性。,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,二、双向复制,(,Bidirectional Replication),复制时双链打开，分开成两股，新链沿着张开的模板生成，复制中形成的这种,Y,字形的结构称为复制叉。,复制叉,(,Replication Fork),TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,AGGTACTGCCACTGG,+,母链,DNA,复制过程中形成,的,复制叉,子代,DNA,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACT,TCCATGA,AGGTACT,TCCATGA,GCCACTGG,CGGTGACC,基因组是环状,DNA,只有,一个,复制起始点,原核生物复制时，,DNA,从起始点,(,Origin,),向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为,双向复制,。,原核生物,双向复制,在原核生物双向复制中，,DNA,被描述为眼睛状。为说明方便而做的图为,(,Theta,),形。,Ori,oriC,A.,环状双链,DNA,及复制起始点,(,origin,ori),B.,复制中的两个复制叉,C.,复制接近终止点,(,Termination,ter),ori,ter,A B C,对于细菌、质粒和某些病毒的小环形,DNA,复制，一个复制起点往往就足够了，产生的两个复制叉再环形染色体和起点相对的位置汇合后，复制即告完成。,原核生物是单复制子完成复制，也称为,复制体,。,真核生物每个染色体有多个起始点，是,多复制子,(,Multireplicon),的复制。,习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个,复制子,(,Replicon),。,复制子是独立完成复制的功能单位。,真核生物,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,三、半不连续复制,semi-discontinuous replication,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(,leading strand),随从链,(,lagging strand),顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。,另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为冈崎片段,(,okazaki,fragment),。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影,技术，观察到,DNA,复制中出现一些不连续的片,段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。,原核生物,:10002000个核苷酸,真核生物,:100200个核苷酸,冈崎片段,3,5,DNA,复制的酶学,第二节,The Enzymology of DNA Replication,参与,DNA,复制的物质,底物,(,substrate):,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,聚合酶,(,polymerase):,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶，,模板,(,template):,解开成单链的,DNA,母链,引物,(,primer):,提供3,-,OH,末端使,dNTP,可以依次聚合,其他的酶和蛋白质因子：,拓扑异构酶、解螺旋酶、,单链,DNA,结合蛋白、引物酶、连接酶,简写为,DNA-pol,一、复制的化学反应,(,dNMP),n,+,dNTP,(dNMP),n+1,+,PPi,(1),以单链,DNA,为,模板,(2),以,dNTP,为,原料,(3),引物,提供 3-,OH,(4),聚合方向,(,新链的延长,),只能为,53,(5),遵守碱基互补规律,聚合反应的特点,全称：,依赖,DNA,的,DNA,聚合酶,(,DNA dependent DNA polymerase),简称：,DNA-pol,活性：,1.,53,的聚合活性,2.,核酸外切酶活性,二、,DNA,聚合酶,5,A G C T T C A G G A T,A,3,3,T C G A A G T C C T A G C G A C 5,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,?,能切除突变的,DNA,片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,X,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA,聚合酶的种类,原核生物,真核生物,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,分子量（,kD,),分子数/细胞,多亚基不对称二聚体,109,120,250,有,无,无,53 核酸,外切酶活性,DNA-pol I,DNA-pol II,DNA-pol III,20,？,？,组成,单肽链,400,可能,基因突变后,的致死性,可能,不可能,（,一,）,原核生物的,DNA,聚合酶,单肽链,首先被发现，当时称为复制酶,(,replicase),含量最多,用特异的蛋白酶处理后可水解成两个片段:,小片段(,N,端),大片段(,C,端),DNA,聚合酶,I,(DNA-pol I),DNA-pol （109kD）,功能：,去除,RNA,引物，填补空隙，参与,DNA,损伤修复。,323个氨基酸,小片段,5,核酸外切酶活性,大片段/,Klenow,片段,604个氨基酸,DNA,聚合酶活性,5,核酸外切酶活性,N,端,C,端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow,片段是实验室合成,DNA,，,进行分子生物学研究中常用的工具酶。,F,G,具有5,3,的聚合酶活性,只是在无,pol,及,pol,的情况下暂时起作用,对模板的特异性不高,参与,DNA,损伤的应急状态修复(,SOS,修复)。,DNA-pol,（,120kD,）,功能：,是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol (250kD),由10种亚基组成不对称的聚合体,、,亚基组成核心酶,亚基具有5,3,的聚合活性；,亚基具有3,5,外切酶活性(校正功能)；,亚基可能起组装作用。,核心酶,DNA,聚合酶(核心酶)的三维结构,聚合酶活性中心:,位于手掌上部，即手指,和拇指接合部；,3,5,外切酶活性中心:,位于手掌底部,。,手掌结构域,手指结构域,拇指结构域,个核心酶,1 个,-,复合物（,、,、,、,、,、,6,种亚基）,DNA,聚合酶全酶结构,可滑动的,DNA,夹子（含1对,-,亚基）,两边的,亚基(,DNA,夹子)起着夹稳模板,链，负责酶沿,DNA,模板滑动的作用。,其余亚基统称为,-,复合物,是,DNA,夹子加,载蛋白，负责将,DNA,夹子加载于,DNA,，,使,DNA,聚合酶 具有持续合成能力。,E.Coli,中的,DNA,聚合酶,催化,DNA,聚合,参与,DNA,损伤的应急状态修复,修复合成、切除引物、填补空隙,功能,20,40,400,分子数/细胞,10,1,1,亚基数,+,-,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,外切酶活性,+,+,+,5,聚合酶活性,pol III,pol II,pol I,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性,DNA-pol,参与低保真度的复制,DNA-pol,在,线粒体,DNA,复制,中起催化作用,DNA-pol,延长子链的主要酶，,有解螺旋酶活性,DNA-pol,在复制过程中起,校读、修复和填补缺口,的作用,（二）真核生物的,DNA,聚合酶,真核生物的,DNA,聚合酶,填补引物空隙，切除修复，重组,延长子链的主要酶，,解螺旋酶活性,线粒体,DNA,复制,低保真度,的复制,起始引发，引物酶活性,功能,3,5,核酸外切,酶活性,-,-,+,+,+,5,3,聚合活性,中,？,高,高,高,分子量（,kD,）,16.5,4.0,14.0,12.5,25.5,DNA-pol,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能,准确传代的基本原理。,复制保真性的酶学机制：,（一）,DNA-pol,的核酸外切酶活性和即时校读,（二）复制的保真性和碱基选择,三、复制保真性的酶学依据,A：,DNA-pol,的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正,确配对的底物。,B：,碱基配对正确，,DNA-pol,不表现活性。,（一）,DNA-pol,的核酸外切酶活性和即时校读,DNA,聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二,酯键）键的有序形成。,DNA-pol III,亚基具有碱基选择功能。,嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键,配对，嘌呤应处于,反式构型,。,（二）复制的保真性和碱基选择,1.遵守严格的碱基配对规律；,2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；,3.复制出错时,DNA-pol,的即时校读功能。,DNA,复制的精确度极高，在细菌中其误差,只有10,-8,10,-10,左右。,DNA,复制的保真性至少要依赖,三种机制,DNA,分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把,DNA,解成单链，它才能起模板作用。,四、复制中的分子解链及,DNA,分子拓扑学变化,（一）解螺旋酶、引物酶和单链,DNA,结合蛋白,模板对复制的指导作用在于碱基的准确配对，而碱基却埋在双螺旋的内部，只有把,DNA,解开成单链，它才能起模板作用。,作用是利用,ATP,供能，解开,DNA,双链,。,（,rep,蛋白，,DnaB,，,解链酶),解(螺)旋酶(,helicase),依赖,DNA,的,RNA,聚合酶。,对利福平不敏感。,可以催化游离,NTP,聚合。,在大肠杆菌，是,dnaG,基因的表达产物。催化,RNA,引,物的生成。,引物作用：为,DNA,聚合提供3-,OH,末端。,引物酶,(,primase),与,DNA,单链紧密结合。,为同源四聚体。,有正协同效应。,是不断地结合、脱离的。,SSB,的作用：,维持模板处于单链状态并保护单链的完整。,单链,DNA,结合蛋白,(,SSB),拓扑：,是指物体或图像作弹性移位而保持物体,不变的性质。,拓扑酶：,改变,DNA,拓扑构象，理顺,DNA,链。,（二）,DNA,拓扑异构酶,(,DNA topoisomerase),既能水解、又能连接磷酸二酯键,分类：,拓扑异构酶,拓扑异构酶,拓扑异构酶作用特点,曾用名：原核生物,-,蛋白,真核生物转轴酶、解缠酶、切口-封闭酶,和松弛酶,主要作用：切开,DNA,双链中的一股，,使,DNA,解链旋转中不打结，在适当时候又把切口封闭，使,DNA,变为松弛状态。,催化反应不需,ATP,拓扑异构酶,I(topo I),:,在原核生物又叫,旋转酶,(,gyrase),。,真核生物中又分为几种亚型。,无,ATP,时，,能切断,DNA,双,链，使螺旋松弛。,在,利用,ATP,供,能下,，,连接断端，松弛的,DNA,进入负超螺,旋状态。,拓扑异构酶,II(topo II),:,连接,DNA,链 3,-,OH,末端和相邻,DNA,链 5,-,P,末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的,DNA,链连接成一条完整的链。催化作用需要,ATP(,或,NAD+),。,注：,只能连接碱基互补基础上的,双链中的单链切口,，没有连接单独存在,DNA,单链或,RNA,单链的作用。,五、,DNA,连接酶,DNA,连接酶,(,DNA ligase),作用方式,功能,DNA,连接酶在复制中起最后接合,双链中单链缺口,的作用。,在,DNA,修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。,也是基因工程的重要工具酶之一。,第三节,DNA,生物合成过程,The Process of DNA Replication,一、原核生物的,DNA,生物合成,需要解决两个问题：,1.,DNA,解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供 3,-,OH末端;形成引发体。,（一）复制的起始,E.coli,复制起始点,oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-TTATACACA-,-,TTTGGATAA-,-,TTATCCACA,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1.,DNA,解链,复制起始的解链需要多种蛋白质(主要由,DnaA,B,C,),参与。,这些蛋白质与复制起始点的特有序列结合，促使其邻近的,DNA,解链。,DnaA,蛋白,作用：,辨认复制起始点,结合,oriC,的4个,9,bp,反向重复序列形成,复制起始复合物,。,作用于,oriC,的3个,13,bp,正向重复序列，,DNA,在这3个位点,解链，形成,开放型复合物,（,opencomplex）,。,DnaB,蛋白,作用：,解开,DNA,双链,5,3,解旋酶作用产生两条复制模板链,激活引发酶,DnaG,蛋白,DnaB,蛋白与引发(物)酶结合，形成引发体,DnaC,蛋白,作用：,运送和协同,DnaB,Dna A,Dna B、DnaC,DNA,拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2.引发体和引物,含有解螺旋酶、引物酶和,DNA,复制起始区域的复合结构称为引发体。,是短链,RNA,。,长度一般为1112个核苷酸,合成方向是 5,3,方向。,提供的 3,-,OH,，,可在,DNA-pol,催化下，利用,dNTP,生成磷酸二酯键。,引物,复制的延长指在,DNA-pol,催化下，,dNTP,以,dNMP,的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,（二）复制的延长,在复制叉同时合成前导链和后随链,原核生物基因是环状,DNA,，,双向复制的复制片段在复制的终止点,(,ter),处汇合。,ori,ter,E.coli,82,32,ori,ter,SV40,50,0,（三）终止阶段,Simian virus 40,5,5,5,RNA,酶,OH,P,5,DNA-poldNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA,连接酶,随从链上不连续性片段的连接,细胞能否分裂，决定于进入,S,期及,M,期这两个关键点。,G1S,及,G2M,的调节，与蛋白激酶活性有关。,蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,二、真核生物的,DNA,生物合成,哺乳动物的,细胞周期,DNA,合成期,端粒,(,telomere),指真核生物染色体线性,DNA,分子,末端的结构,通常膨大成粒状。,结构特点：,由末端,DNA,序列和蛋白质构成。,末端,DNA,序列是多次重复的富含,G、T,碱基的短序列。,功能：,维持染色体的稳定性,维持,DNA,复制的完整性,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,端粒酶(,telomerase),线性,DNA,在复制完成后，其末端由于引物,RNA,的水解而可能出现缩短。故需要在,端粒酶,（,telomerase,）,的催化下，进行延长反应。,端粒酶(,telomerase,),端粒酶是一种,RNA,-,蛋白质复合体，它可以其,RNA,为模板，通过逆转录过程对末端,DNA,链进行延长。,端粒酶,RNA,(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白,(,human telomeraseassociated protein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(,human telomerase reverse transcriptase,hTRT),端粒酶,(,telomerase),组成,DNA,聚合酶复制子链,进一步加工,成年人端粒比胚胎细胞端粒短,老化与端粒酶活性下降有关,肿瘤的发生与端粒酶活性有关,端粒酶不一定能决定端粒的长度,端粒及端粒酶的意义,第四节,逆转录和其他复制方式,Reverse Transcription and Other DNA,Replication Ways,一、逆转录病毒和逆转录酶,逆转录,(,reverse transcription),逆转录酶,(,reverse transcriptase),RNA,DNA,逆转录,酶,逆转录,以,RNA,为模板，合成与其互补的,DNA,的过程。,逆转录酶,从,RNA,病毒中发现能催化以,RNA,为模板合成双链,DNA,的酶，全称为依赖,RNA,的,DNA,聚合酶。,有三种活性：,以,RNA,为模板的,dNTP,聚合活性,以,DNA,为模板的,dNTP,聚合活性,RNase,活性,RNA,模板,逆转录酶,DNA-RNA,杂化双链,RNA,酶,单链,DNA,逆转录酶,双链,DNA,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,逆转录酶,A AA A,T T T T,AAAA,SI,核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,N N,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为,cDNA,法。,以,mRNA,为模板，经逆转录合成的与,mRNA,碱基序列互补的,DNA,链。,试管内合成,cDNA,cDNA,complementary DNA,N,N,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。,逆转录现象说明：至少在某些生物，,RNA,同样兼有遗传信息传代与表达功能。,对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,二、逆转录研究的意义,第五节,DNA,损伤（突变）与修复,DNA Damage(Mutation)and Repair,突变发生在对生命至关重要的基因上，可导致个体或细胞的死亡。,突变导致死亡,突变是某些疾病的发病基础,包括遗传病、肿瘤及有遗传倾向的病。有些已知其遗传缺陷所在。但大多数尚在研究中。,自发性:,自然错配率约为10,-9,10,-10,左右,物理因素:,如,UV(ultra violet)、,各种辐射,化学因素:,烷化剂、碱基类似物、以及其他一些人工合成或环境中存在的化学物质，这些都是诱发突变的化学物质,称为,致癌剂,。,生物因素:,抗菌素类、黄曲霉素和病毒等,引发突变的因素,镰形红细胞贫血病人,Hb(HbS),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,val,glu,C,肽链,C,A,C G,T,G,基因,正常成人,Hb(HbA),亚基,N,-val,his,leu,thr,pro,glu,glu,C,肽链,C,T,C G,AG,基因,错配,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,是一种,切除修复,有缺陷的遗传性疾病。在研究其发病机制时，发现一些相关的基因，称为,XPA、XPB、XPC,等。这些基因的表达产物与,Uvr,类蛋白有同源序列，也是起辨认和切除损伤,DNA,作用的。,XP,病人是由于,XP,基因有缺陷，不能修复紫外线照射引起的,DNA,损伤，因此易发生皮肤癌。,着色性干皮病,（,xeroderma pigmentosis，XP）,1、概念,（1）基因（2）复制,（3）,DNA,的半保留复制（4）中心法则,（5）冈崎片段（6）复制子,（7）,Klenow,片段（8）端粒,（9）端粒酶（10）逆转录,复习思考题,2.如何用实验证明,DNA,的半保留复制？,3.参与,DNA,复制的酶类有哪些？各有何作用？,4.原核生物和真核生物的,DNA,聚合酶有何区别？,5.简述,DNA,复制的体系。,6.,DNA,复制和逆转录有何异同？,