HPLC-基础知识.ppt

单击此处编辑母版标题样式,liuq1217,*,易水寒江雪敬奉,单击此处编辑母版标题样式,*,易水寒江雪敬奉,R&D,生命的意义在于拼搏，坚定自己的道路，勇往直前,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,liuq1217,*,色谱分析法简介,色谱法的分类,HPLC的特点及应用领域,HPLC的分类,HPLC相关的基本术语,HPLC的相关理论,目录,HPLC的定性分析,HPLC的定量分析,HPLC仪器的组成,输液泵,检测器,色谱柱,进样器,工作站,P230的基本操作,HPLC方法的建立,液相色谱常见问题及其对策,液相色谱容易出问题的部件,仪器的维修和保养色谱法的分类,1.,按两相状态分类,气体为流动相的色谱称为,气相色谱（GC）,根据固定相是固体吸附剂还是固定液（附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体），又可分为,气固色谱（GSC）和气液色谱（GLC）,液体为流动相的色谱称,液相色谱（,LC,）,同理液相色谱亦可分为,液固色谱（,LSC,）和液液色谱（,LLC,）,随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体表面，这种化学键合固定相的色谱又称,化学键合相色谱（,CBPC,）,超临界流体为流动相的色谱为,超临界流体色谱（,SFC,）,2.按分离机理分类,利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为,吸附色谱法,利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为,分配色谱法,利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为,离子交换色谱法,利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为,凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法,最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为,亲和色谱法,，常用于蛋白质的分离,3.按固定相的外型分类,固定相装于柱内的色谱法，称为,柱色谱,固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为,薄层色谱和纸色谱,4.按照展开程序分类,按照展开程序的不同，可将色谱法分为,洗脱法,、,顶替法,、,和迎头法洗脱法也称冲洗法,。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，,然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂,。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线下图,A,B,这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中,最常用,的一种方法,顶替法,是将样品加到色谱柱头后,，,在惰性流动相中加入对,固定相的吸附或溶解能力比所有试样组分强的物质为顶替剂,（或直接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依次顶替出固定相,很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲线如下图,A,B,此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其,缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和,，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用,迎头法是将试样混合物连续通过色谱柱,，,吸附或溶解能力最弱的组分首先以纯物质的状态流出，其次则以第一组分和吸附或溶解能力较弱的第二组分混合物，以此类推。流出曲线如下图,该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离,按流动相分,气相色谱（GC）,液相色谱（LC）,超临界流体色谱（SFC）,按机理分,吸附色谱,分配色谱,离子交换色谱,排阻色谱,按固定相在支持 体中的形状分,柱色谱,平板色谱,纸色谱,薄层色谱,按分离效率分,经典液相色谱,高效液相色谱,HPLC的特点,适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物,分离原理图解,优点：,检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，,定量精度高，应用范围广,缺点：,价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分,子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多,HPLC应用领域,HPLC是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域,应用领域,分析对象举例,环境,常见无机阴阳离子、多环芳烃、多氯联苯、硝基化合物、有害,重金属及其形态、除草剂、农药、酸沉降成分,农业,土壤矿物成分、肥料、饲料添加剂、茶叶等农产品中无机和有,机成分,石油,烃类族组成、石油中微量成分,化工,无机化工产品、合成高分子化合物、表面活性剂、洗涤剂成分、,化妆品、染料,材料,液晶材料、合成高分子材料,食品,无机阴阳离子、有机酸、氨基酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、,甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳,烃,生物,氨基酸、多肽、蛋白质、核糖核酸、生物胺、多糖、酶、天然,高分子化合物,医药,人体化学成分、各类合成药物成分、各种天然植物和动物药物,化学成分,HPLC的分类,高效液相色谱法按照分离机制可以分为以下几类,液-固吸附色谱,液-液分配色谱,离子交换色谱,离子色谱,离子对色谱,排阻色谱,亲和色谱（AC）,液-固吸附色谱,固定相,：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂,流动相,：各种不同极性的一元或多元溶剂,基本原理,：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸附,适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性,固定相与流动相均为液体（互不相溶）,流动相,：各种不同极性的一元或多元溶剂。,固定相,：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用。现今多采用,化学键合固定相,：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。例如：C-18柱（反相柱）,基本原理,：组分在固定相和流动相上的分配,对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（,正相,normal phase,），反之，流动相的极性大于固定液的极性（,反相,reverse phase,）。正相与反相的出峰顺序相反,液-液分配色谱,离子交换色谱,ion-exchange chromatography,固定相,：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂,流动相,：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液,基本原理,：组分在固定相上发生的反复离子交换反应组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长,阳离子交换：RSO3H +M+=RSO3 M +H+,阴离子交换：RNR4OH +X-=RNR4 X+OH-,应用,：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等,离子色谱,ion chromatography,离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法,离子对色谱,原理,：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配,阴离子分离,：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子,阳离子分离,：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子,反相离子对色谱,：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配,排阻色谱色谱,size-exclusion chromatography,固定相,：,凝胶(具有一定大小孔隙分布),原理,：,按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰,亲和色谱(AC),Affinity,chromatograph,原理,：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱,HPLC相关的基本术语,固定相,流动相,色谱流出曲线和色谱峰,基线和峰高,保留值,区域宽度,分离度,溶剂等级,液相色谱固定相,stationary phases of LC,定义：,在HPLC分离过程中，在柱内静止不动的一相，即柱内填料,1.液-液分配及离子对分离固定相,（1）全多孔型担体,由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体，早期采用,100,m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见,现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料,（2）表面多孔型担体,（薄壳型微珠担体）,3040,m的玻璃微球，表,面附着一层厚度为1 2m,的多孔硅胶,表面积小，柱容量底,（3）化学键合固定相,化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相,a.硅氧碳键型：,SiOC,b.硅氧硅碳键型：,SiOSi C,稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广,c.硅碳键型：,SiC,d.硅氮键型：SiN C18,十八烷基硅烷键合硅胶,（1）,传质快,，,表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快,（2）,寿命长,，,化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击,耐水、耐光、耐有机溶剂，,稳定,（3）,选择性好,，,可键合不同官能团，提高选择性,（4）,有利于梯度洗脱,化学键合固定相的特点,存在着,双重分离机制,(键合基团的覆盖率决定分离机理),高覆盖率：分配为主,低覆盖率：吸附为主,2.液-固吸附分离固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等,结构类型：全多孔型和薄壳型,粒度：510,m,3.,离子交换色谱,分离固定相,结构类别：,（1）薄壳型离子交换树脂,薄壳玻璃珠为担体，表面,涂约1%的离子交换树脂,（2）离子交换键合固定相,薄壳键合型；微粒硅胶键,合型键合离子交换基团）,树脂类别：,（1）阳离子交换树脂（强酸性,、弱酸性）,（2）阴离子交换树脂（强碱性,、弱碱性）,4.空间排阻分离固定相,（1）软质凝胶,葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构,水为流动相。适用于常压排阻分离,（2）半硬质凝胶,苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶,非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂,（3）硬质凝胶,多孔硅胶、多孔玻珠等,化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响,小，可在较高流速下使用,可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布,液相色谱的流动相,mobile phases of LC,1.流动相特性,（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动,相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况,（2）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极,性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性,柱也称正相柱,（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液,液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型,分离柱上的出峰顺序相反,2.流动相类别,按流动相组成分,：单组分和多组分,按极性分,：极性、弱极性、非极性,按使用方式分,：等度淋洗和梯度淋洗,常用溶剂,：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇,、乙腈、甲醇、水,采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动,相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,3.流动相的选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据,采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，,若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。,也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使,保留时间缩短,常用溶剂的极性顺序,：,水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮,二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙,醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳,二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期,累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏,柱子。如使固定液溶解流失酸性溶剂破坏氧化铝,固定相等,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀,并在柱中沉积,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检,测器时，流动相不应有紫外吸收,色谱流出曲线和色谱峰,由,检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰,如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的,基线和峰高,基线,在实验操作条件下，,色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线,，稳定的基线应该是一条水平直线,峰高,色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示,信号,进样,h,a,色谱流出曲线,色谱峰,色谱流出曲线和色谱峰,基线（a）,峰高（h）,保留值,1.死时间t,M,不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时，从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间，它正比于色谱柱的空隙体积，如下图,信号,进样,t,M,因为这种物质不被固定相吸附或溶解，故,其流动速度将与流动相流动速度相近。,测定流动相平均线速时，可用柱长L与t,M,的比值计算，即,=L/t,M,2.保留时间t,R,试样从进样到出现峰极大点时所经过的时间，称为保留时间，如下图,信号,进样,t,R,3.校正保留时间t,R,某组分的保留时间扣除死时间后，称为该组分的,校正保留时间,，,即,t,R,=t,R,t,M,由于组分在色谱柱中的保留时间,t,R,包含了组分随流动相通过柱子所需的时间和组分在固定相中滞留所须的时间，,所以t,R,实际上是组分在固定相中保留的总时间,保留时间是色谱法定性的基本依据，,但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响,4.相对保留值r,2,1,某组分2的校正保留值与组分1的校正保留值之比，称为相对保留值,r,2,1,=t,R2,/t,R1,由于相对保留值只与柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，因此广泛,用作定性的依据,在定性分析中，通常固定一个色谱峰作为标准（s），然后再求其它峰（i）对这个峰的相对保留值，此时可用符号,表示，即,=t,R,(i),/t,R,(s)式中t,R,(i),为后出峰的校正保留时间，所以,总是大于1的。相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子,色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，用于衡量柱效率及反映色谱操作条件的动力学因素。表示色谱峰区域宽度通常有,三种方法,区域宽度,1.标准偏差,-,即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半,2.半峰宽Y,1/2,-,即峰高一半处对应的峰宽。它与标准偏差的关系为,Y,1/2,=2.354,3.峰底宽度Y,-,即色谱峰两侧拐点上的切线在基线上截距间的距离。它与标准偏差,的关系是,Y=4,从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：,(i),根据色谱峰的个数,，可以判断样品中所,含组分的最少个数,(ii),根据色谱峰的保留值,，可以进行定性分,析,(iii),根据色谱峰的面积或峰高,，可以进行定,量分析,(iv),色谱峰的保留值及其区域宽度,，是评价,色谱柱分离效能的依据,(v),色谱峰两峰间的距离,，是评价固定相,（或流动相）选择是否合适的依据,分离度,分离度R是一个综合性指标,分离度是既能反映,柱效率,又能反映,选择性,的指标，称总分离效能指标。分离度又叫分辨率，它定义为相邻两组分色谱峰保留值之差与两组分色谱峰底宽总和之半的比值，即,R=2(t,R2,-t,R1,)/Y,1,+Y,2,R值越大，表明相邻两组分分离越好。一般说，当R10时，随容量因子增大，分离度的增长是微乎其微的。一般取,k,为,2-10,最宜,控制,k的方法：,改变流动相的组成,4.分离度与分析时间的关系,从图中tr,/Q对,k,的曲线可见，当,k,在,2-5,时，可在较短的分析时间，取得良好的分离度,溶剂等级,水的等级,纯化水,蒸馏水,去离子水,波长(nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子水的吸光率较高,纯化水中去除了无机和有机的污染物,吸光率,溶剂的等级,HPLC级,优级纯,分析纯,都经过蒸馏和0.45u的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒,优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂,HPLC级经过0.2u的过滤,且除去有紫外吸收的杂质,甲醇 乙睛 正己烷,分析纯级和 HPLC 级溶剂的吸光度比较图,色谱分析的,目的,是将样品中,各组分彼此分离,，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关,但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，,要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为,HPLC的相关理论,分配系数K和分配比,k,塔板理论,速率理论,HPLC的相关理论,分配系数K和分配比,k,1.分配系数K,分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的,分配,过程，而吸附色谱的分离是基于反复多次的,吸附-脱附,过程,这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述，而描述这种分配的参数称为分配系数K。,它是指在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值，即,K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度,=,C,s/,C,m,分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的，它是每一个溶质的特征值，它仅与两个变量有关：,固定相和温度,。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关,2.分配比,k,分配比又称,容量因子,，它是指在一定温度和,压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配,在固定相和流动相中的物质的量比。即,k,=组分在固定相中的物质的量 /,组分在流动相中的物质的量,=,n,s,/,n,m,k,值越大，说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量大，因此又称,分配容量或容量因子,。它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。,k,值也决定于组分及固定相热力学性质。,它不仅随柱温、柱压变化而变化，而且还与流动相及固定相的体积有关,3.分配系数K与分配比,k,的关系,K=,kV,S,/V,M,=,k.,其中,称为相比,，它是反映各种色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其值一般为6-35；对毛细管柱，其值为60-600,4.,滞留因子Rs,滞留因子Rs,值可直接从色谱图测得。设流动相在柱内的线速度为u，组分在柱内线速度为u,s,，由于固定相对组分有保留作用，所以u,s,u此两速度之比称为,滞留因子Rs,Rs若用质量分数表示，即,对组分和流动相通过长度为L的色谱柱，其所需时间分别为,整理上面两式可得,4.分配系数 K 及分配比,k,与选择因子的关系,对A、B两组分的选择因子，用下式表示：,=t,R,(B)/t,R,(A),=,k,（A）/,k,（B）,=K（A）/K（B）,通过选择因子把实验测量值,k,与热力学性质的,分配系数K直接联系起来，对固定相的选择具,有实际意义,如果两组分的K或,k,值相等，则,=1，两个组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或,k,值相差越大，则分离得越好,。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件,下图是 A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓,浓度,沿柱移动距离 L,A,B,A,B,K,A,K,B,图中K,A,K,B,，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。,若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：,两组分的分配系数必须有差异,区域扩宽的速率应小于区域分离的速度,在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱,塔板理论,把色谱柱比作一个精馏塔，沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为，,同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标,，即色谱柱是由一系列连续的、相等的水平塔板组成。每一块塔板的高度用,H表示，称为塔板高度，简称板高,塔板理论假设：,1.,在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H,2.,以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（V,m,）,3.,所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略,4.,分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关,简单地认为：在每一块塔板上，溶质在两相间很快达到分配平衡，然后随着流动相按一个一个塔板的方式向前移动。对于一根长为L的色谱柱，溶质平衡的次数应为：,n=L/H,n称为理论塔板数,。与精馏塔一样，色谱柱的柱效随理论塔板数n的增加而增加，随板高H的增大而减小,塔板理论指出,：,第一,当溶质在柱中的平衡次数，即理论塔板,数,n大于50时,，可得到基本对称的峰形曲,线,第二,当样品进入色谱柱后，只要各组分在两,相间的分配系数有微小差异，经过反复,多次的分配平衡后，仍可获得良好的分,离,第三,n与半峰宽及峰底宽的关系式为：,n=5.54(t,R,/Y,1/2,),2,=16(t,R,/Y),2,式中t,R,与Y,1/2,(Y)应采用同一单位（时间,或距离）。从公式可以看出，在t,R,一定,时，如果色谱峰很窄，则说明n越大H越,小，柱效能越高,在实际工作中，由公式,n=L/H,和,n=5.54(t,R,/Y,1/2,),2,=16(t,R,/Y),2,计算出来的的n和H值有时并不能充分地反映色谱柱的分离效能，因为采用t,R,计算时，没有扣除死时间t,M,，所以常用有效塔板数n,有效,表示柱效：,n,有效,=5.54(t,R,/Y,1/2,),2,=16(t,R,/Y),2,有效板高：,H,有效,=L/n,有效,塔板理论是一种半经验性理论。,它用热力学的观,点,定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流,出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效高低的参数,但是,，色谱过程不仅受热力学因素的影响，,而,且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，,因此塔,板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高,受哪些因素影响；也不能说明为什么在不同的流速,下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应,用,速率理论,速率理论基本方程,H=A+B/u+C u,式中u为流动相的线速度；A、B、C、为常数，分别代表涡流扩散系数、分子扩散项系数、传质阻力项系数,上式也称范.第姆特（Van Deemeter）方程，速率理论,吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素,1.涡流扩散项,A,在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似涡流的流动，故称,涡流扩散,涡流扩散示意图,由于填充物颗粒大小的不同及填充物的不均匀性，使组分在色谱柱中路径长短不一，因而同时进色谱柱的相同组分到达柱口时间并不一致，引起了色谱峰的变宽。色谱峰变宽的程度由下式决定：,A=2dp,上式表明，,A与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子有关,，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。,对于空心毛细管，不存在涡流扩散，因此 A=0,2.分子扩散项 B/u（纵向扩散项）,纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“,塞子,”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。,分子扩散项系数为,B=2 D,g,B/u（纵向分子扩散项）指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽,B=2,D,m,式中：弯曲因子，填充柱 4,000,选择 300 的孔径,大孔径填料适用于大分子分析,大孔径300 全多孔色谱柱,可用于分离蛋白质和多肽,分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子,Poroshell 色谱柱,高流速下,高柱效分析大分子的蛋白质和多肽,色谱柱填料孔径必须适合待测物分子自由进出填料孔,与孔内表面的键合相进行分离分配,键合类型 -对色谱分离的影响,单齿键合：,提高传质速率,加快色谱柱平衡,双齿键合：,增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量,CH,CH,CH,CH,CH,CH,O,Si,O,O,O,O,Si,Si,Si,CH,CH,CH,CH,CH,CH,Si,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,3,Si,Si,O,O,Si,Si,O,O,碳覆盖率-对色谱分离的影响,高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长,低碳覆盖率：缩短运行时间,封端 -对色谱分离的影响,封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象,对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异,传统键合及封端技术,固定相键合,二甲基硅烷,封端,四甲基硅烷,Si,O,OH,O,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,R=C8,C18,etc,.,O,OH,OH,O,CH,3,Si,R,CH,3,CH,3,Si,R,CH,3,+,+,Cl,CH,3,Si,CH,3,CH,3,OH,OH,OH,OH,CH,3,Cl,R,CH,3,(,TMS),HPLC常用的色谱柱接头,0.09 in.=2.33 mm,Swagelok,安捷伦1100液相,Parker,Valco,Uptight,0.09 in.=2.33 mm,0.08 in.=2.07 mm0.09 in.=2.33 mm,0.13 in.=,3.37mm,0.17 in.=4.40mm,Waters,Rheodyne,如果伸出的管线长度过长，可能漏液,螺母坡度不匹配，密封性差,死体积区,如果伸出的管线长度不够，可能产生死体积,分析结果重现性好,提高柱效,降低柱压,保证检测稳定性,柱温箱的作用,分 析 柱 的 维 护,在,使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下,(0.2-0.3 ml/min),冲洗,30,mins,，,长时间未用的分析柱也要同样 处理,定期使用强溶剂冲洗柱子,3,、使用缓冲盐时，要先用水冲洗，再用有机溶剂冲洗,4,、,净化样品,5,、分离条件,6,、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干枯,提高柱效的方法,色谱柱本身,减小填料的颗粒度,找到最佳的流速(根据不同内径),合适的温度,降低溶剂的粘度,增加柱长,其他影响柱效的因素,柱外效应,连接管路,进样器、检测器,进样体积,进样量,容量因子 k,改变k值的方法,调节流动相的极性、pH、离子强度等,梯度淋洗,与峰高的关系,与R的关系,选择性系数,a,定义,a,=1 时两组分分不开,改变,a,的途径,改变固定相,改变流动相,改变温度,改变样品的本身性质,a,，k，,N对分离度的影响,色谱柱的保护、平衡和保存,纯样品分析不加保护柱也许可以，复杂和天然样品必须加上保护柱（有各种类型），延长分析柱的寿命,色谱柱的平衡在流动相中已经提到了，注意流动相的pH值，过低和过高将损伤柱子。当有机相比例很高时，盐浓度不能太高，否则温度低的话，盐析出将引起柱子和管路的杜塞，压力大增,含盐的流动相在分析完后，应用水洗去盐，再换成有机溶剂,色谱柱的保存，参照说明书，反相柱一般在甲醇或乙腈中,色谱柱的清洗,用比你的流动相更强的溶剂冲洗,为了增加强度选择反相溶剂,对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗,没有缓冲盐的流动相,100%Methanol 甲醇,100%Acetonitrile 乙腈,75%Acetonitrile:25%Isopropanol,75乙腈：25异丙醇,100%Isopropanol 异丙醇,100%Methylene Chloride,二氯甲烷,100%Hexane,已烷,当用已烷或二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相,色谱柱的维修-物理阻塞,在安装之前前后测试压力差,如果柱压太高,反装色谱柱,并用10-20倍体积的流动相冲洗色谱柱,监测压力变化.,若出现沉淀,(如:蛋白凝聚、细胞物、聚合物)设法用相应的可溶性溶剂，如0.1%TFA80乙腈，6M盐酸胍、THF等）,若还无效，更换过滤片,色谱柱,修复和再生-化学变化,由于键合相的水解或硅胶的溶解而造成的色谱柱填料的变化是不可逆的,由于污染而产生的色谱柱变化可以通过适当的清洗使之修复,梯度洗脱的方式(水-强有机溶剂)通常最有效,低 pH 流动相,如 0.1%TFA or 0.01M H,3,PO,4,也是有效的,升高温度（60-80）,色谱柱使用的几个注意点,样品和流动相过滤,柱子反做(当正做实在不行时),当柱压明显升高时，对柱头塞板清洗及更换部分填料,少使用离子对试剂,色谱柱避免强酸强碱接触，选择合适保存条件,分析时，避免长时间色谱柱进大量气泡，长时间不用，经常保存流动相过，防止柱子干掉,进样器,进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式,进样器要求,密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小,自动进样器,手动进样器,六通阀,注入方式：,1）全量注入,2）部分注入工作原理,1、手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出,2、将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液相分析柱进行分析。,六通阀原理图,管线连接,进样量和检测器响应的关系示意图,进样体积,检测器响应值,定量,环,体积的一半,3倍定量,环,体积,全量注入,部分注入,交叉污染的原因,微量注射器,红色表示残留样品,一般的方法,1.在进样状态下清洗针口,2.在装填状态下插入微量注射器,3.注入样品,4.切到进样状态,便捷的方法（不需清洗）,1.进样状态下插入微量注射器,2.切到装填状态,3.注入样品,4.切回到进样状态,工作站,主要进行数据采集好数据图谱处理,P230的基本操作,开机前的准备,仪器操作步骤,开机,流动相更换,进样,图谱处理,流动相更换,关机,开机前的准备,1、查看仪器使用记录，了解仪器状况。尽量,避免仪器带故障工作,2、所有存放流动相和样品的容器必须经常清,洗保持洁净，所有流动相、样品必须经过,过滤；流动相必须充分的超声脱气,3、未使用完的流动相如需继续使用必须重新,过滤、脱气,流动相的制备,过滤：,0.45um,或更小孔径滤膜,目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液,脱气：,除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡,气泡对测定的影响：,1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积,2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形,3）检测器中的气泡产生基线波动,无在线脱气应注意：,1）每天脱气,2）如使用氦脱气，对混合溶剂脱气时间不能过长,梯度洗脱装置：,高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入,低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。,梯度洗脱形式：,线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例,指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系,折线梯度：,梯度洗脱：,优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度,注意事项：,溶剂的纯度要高否则梯度洗脱的重现性差,梯度混合的溶剂互溶性要好,梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）,吹氦脱气法,加热回流法,抽真空脱气法,超声波脱气法,在线真空脱气法,流动相脱气,1.取下过滤头放在(1:4,V/V)的硝酸溶液烧杯中超声清洗15分钟;,2.取出后用蒸馏水超声清洗10分钟;,3.用吸球吹出过滤头中的液体;,4.再用蒸馏水超声清洗10分钟;,5.用吸球吹净过滤头中的水份;,6.将过滤头重新插入溶剂瓶中(正相系统注意将过滤头烘干),溶剂过滤头的清洗,流动相的选择和注意事项,常用试剂的级别纯度：采用“HPLC”级溶剂,水的纯度：去离子水，最好用二次重蒸水,乙腈的特性：低波长吸收小，极性较甲醇大有一定的粘黏度（易使单向阀粘黏），对PEEK及Tefl管有侵蚀性,使用二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿溶剂时，对PEEK管和头有侵蚀作用，因此请勿将两者在一起使用,过滤：用0.45um,或更小孔径滤膜,目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱、在线过滤板及进样器,HPLC级的试剂有些也应过膜。水也应过膜。尤其是缓冲液必须过膜,注意滤膜的质量,更换互溶流动相时注意清洗吸滤头,更换不互溶流动相时必须用中间过渡液清洗系统，例如异丙醇,更换缓冲液时，应用纯水过渡,更换流动相后应使用PURGE键快速排液。排去残液或气泡,注意缓冲液的pH值与使用的色谱柱匹配,缓冲液必须过滤膜,使用缓冲液期间，用注射器推纯水，清洗柱塞杆，延长泵密封垫寿命,分析完后用纯水清洗系统,仪器准备,1、打开P230高压恒流泵后部的电源开关，设定仪器操作参数。启动高压恒流泵运行，待系统压力稳定后可准备更换流动相,2、打开UV230紫外可见检测器后部的电源开关，根据需要设定仪器操作参数。待氘灯、钨灯点亮后按下检测器前面板的自动回零键,3、打开计算机和EC2000色谱数据工作站前面板的电源开关，并启动EC2000色谱数据工作站软件,4、用20:80的甲醇:水置换系统中的甲醇：首先按下高压恒流泵前面板的运行键停止泵运行，将流动相的吸滤头从甲醇溶剂中取出放入20:80的甲醇:水容积瓶中；打开排空阀旋钮并按下冲洗键快速排出液体约20毫升左右。再次按下冲洗键并关闭排空阀。按下运行按钮启动高压恒流泵置换系统内的甲醇。待系统压力稳定、基线平稳后置换过程完毕(如果分析试验使用的流动相中含有缓冲盐这一步操作是绝对不可省略的),5、用准备好的流动相置换系统中的20:80的甲醇:水，操作方法同上,6、根据分析样品需要设定检测器的检测波长，等待系统压力和基线稳定后按下检测器前面板的自动回零按钮。即可准备进行样品分析,开机后检查,送液泵：进液管是否有气泡，压力显示？是否波动太大（0.3-0.5 MPa之内)，有无漏液,柱温箱：温度设定，Oven 键开启，是否升温,检测器：开机后自检正常，出现初始画面，确认分析波长,基线检查：噪声、波动和漂移,经验,一般在开机后，可以等基线稳定在点亮氘灯或者钨灯，这样可以延长钨灯和氘灯使用寿命,样品分析,1、将EC2000色谱数据工作站软件设定为等,待采集状态,2、将六通进样阀搬到取样位置，用微量进样,器抽取适量过滤好的样品；将进样针插入,进样阀底部。缓慢将样品推入定量环；,然后快速将进样阀搬之进样位置,3、待样品各组分峰出完后可停止数据采集并,保存色谱数据,增加柱效的小方法,提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）,减小柱内径，可增加柱效（提高灵敏度）,缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）,减小柱外体积，可增加柱效（提高灵敏度）,使用超纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）,使用高能量氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）,使用中孔透光氘灯，可增加柱效（提高灵敏度）,改变流动相,pH,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变有机相,%,，可增加柱效（提高灵敏度）,改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）,改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度）,改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度）,关机,注意事项,保存数据，退出工作站,清洗柱子及系统,保留在柱子和系统中的液体（甲醇或异丙醇），水能够发霉及长菌，乙腈长期保存对吸液管和PEEK头有危害,HPLC方法的建立,反相分配色谱,极性:固定相