Talen技术及诱导多功能干细胞(iPS)在医学领域的发展应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,靶向基因修饰,经典难题：,基因敲除（,Knockout,）,什么是基因敲除：,通过某种方法将一个特定靶基因破坏或失活，使其失去原有的功能,。,为什么要做基因敲除：,基因敲除是寻找、证明基因功能过程中的必要步骤之一，是基因工程和基因治疗的重要手段。,基因敲除的方法,同源重组,(Homologous Recombination),依赖,DNA,分子的互补性，经典基因敲除方法,特点：效率低,（,1 per 10,6,cells,），实验周期长,RNA,干扰,(RNA interference),反义寡核苷酸,(Morpholino),依赖,RNA,分子,的互补性：高效性，特异性；,特点：临时性，基因沉默而非敲除；,锌指核糖核酸酶（,ZFN,）,DNA,识别域,(ZFP),+,非特异性核酸内切酶构成（,FokI),依赖,DNA,识别域的,特异性：效率高,但存在脱靶现象，专利被,Sangamo,垄断,基因敲除的方法,TALEN,的应用,DNA,水平的,基因敲除,DNA,水平的,定点插入,DNA,水平的,单碱基修饰,（点突变）,建立基因敲除,/,敲入的真核细胞系,建立基因敲除,/,敲入的真核生物模型,应用,I:,基因敲除,Nat Biotechnol 2013 Jan;31(1):23-4,TALEN,的实际应用,应用,II,：基因敲入,Nature Biotechnology 29,，,731-734,（,2011,）,TALEN,的实际应用,应用,III:,点突变,TALEN,的实际应用,TALEN,广泛应用,Biotechnol Bioeng.2013 Mar 18.doi:10.1002/bit.24890,拟南芥,短兵草,牛,蟋蟀,果蝇,仓鼠,人,青鳉,小鼠,线虫,大鼠,水稻,蚕,烟草,酵母,斑马鱼青蛙,猪,构建,TALEN,质粒,如何将这些高度重复的,DNA,片段连接起来？,TALEN,的组装,(Golden Gate),PCR 3,步,Digest 2,步,Ligate 2,步,斯丹赛一步法,只要,4-5,小时，这些片段就全部连接起来了,一步连接,1,2,3,6,5,4,9,13,7,10,12,16,8,14,11,15,17,18,So EASY,！,SO FAST,！,FastTALE,TM,连接,TALEN,N,C,N,C,TALEN modules at 9 positions,TALEN backbone vectors,TALEN assembled vectors,Promoter,FokI,Promoter,FokI,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x4,x16,x16,x16,x4,x16,Position 1,Position 2,Position 3,Position 4,Position 5,Position 6,Position 7,Position 8,Position 9,1/2,9 x 16 dimers,7 x 4 monomers,Complete library:172,CMV,EF1a,Ubi,35S,T7,SP6,Maximum RVDs:18.5,Minimum RVDs:11.5,多种TALEN,骨架载体，满足不同物种需求,第一组载体：,干细胞,专用打靶载体，采用,EF1,启动子。,第二组载体：构建,动物模型,专用载体，含有原核表达启动子,sp6,或,T7,，便于体外转录。,第三组载体：,普通细胞,打靶载体，采用,CMV,启动子。,第四组载体：,植物,专用打靶载体，采用,ubiqutin,或,35s,启动子。,TALEN,质粒构建流程,靶点设计,挑克隆,细菌培养,DNA,质粒抽提,酶切鉴定,得到测序,正确质粒,TALEN,连接,细菌转化,质粒测序鉴定,Day 1,Day 2,Day 3,Day 4,4,天,得到构建正确的,TALEN,质粒！,简单、快速！,靶点设计,Decide TALEN target(left arm/right arm),TALE-NT2.0,https:/tale-nt.cac.cornell.edu/,DNASTAR,12-19bp,Spacer:12-21bp,5,end 0 position:must be T,为了得到高活性质粒，建议设计,2X3,组合。,TALEN,连接,1.,设计序列，,选择模块,2.,加样，,进行连接,4-5h,完成,转化至感受态细胞,在,Kana,+,LB,平板中培养,细菌转化,挑单克隆，细菌培养,挑,5-12,个克隆,（连接效率,50%,）,Kana,+,LB,培养液,单克隆菌落,将单菌落接入含5ml Ka,+,的LB培养液的试管中,DNA,质粒抽提，酶切鉴定,DNA,质粒小抽提,使用,BamHI+PstI,双酶切，植物载体采用,BamHI+SpeI,target:16 nt,target:19 nt,左臂,右臂,1kb Marker,1 kb Marker,Digestion,Digestion,Asssembly length:,15x102=,1530,Asssembly length:,18x102=,1836,On backbone:,531,Total length:,1530+531=,2061,On backbone:,531,Total length:,1836+531=,2367,1,个单模块（由,34,个氨基酸，即,102,个碱基组成）识别一个碱基,上游引物,305:,5-CTCCCCTTCAGCTGGACAC-3,下游引物,306:,5-AGCTGGGCCACGATTGAC-3,S247,引物：,5-GGGAGCACCCCTCAACCTGAC-3,质粒测序,测序结果比对,标准序列,测序结果,得到测序正确质粒,305,306,测序正确质粒,转,染,Mix cell,抽提基因组、,PCR,测序并进行,TA,克隆,打靶效率,细胞单克隆,获得稳定敲除细胞系,药筛,应用实例,1,细胞建系,Hela细胞中,XX,基因敲除的稳转系建立：,项目执行时长,2,个月,设计,TALEN,识别序列；,构建,TALEN,载体；,测序验证,质粒正确性,实验流程：,序列,100%,正确,脂质体转染入,Hela,细胞中；,puromycin,药物筛选,3,天,收集筛选后剩余的部分细胞，抽提基因组,DNA,进行PCR,PCR,产物送测序,比对测序结果，初步确认,TALEN,活性,续上,大于,53%,（每,100,个细胞中有,53,个细胞发生碱基突变）,PCR,产物,TA,克隆、单克隆测序确定打靶效率,续上,2025/10/21 周二,最终挑选出阳性单细胞克隆，扩增，保存，稳定遗传系建立成功,消化细胞呈单细胞，接种于,96,孔板中，待单细胞克隆长大后，同上进行鉴定,部分单细胞克隆测序结果：,单克隆鉴定结果表明：基因改变类型包括插入和缺失两种形式，造成基因移码突变，成功构建稳转系。,根据打靶效率，挑取一定数量单克隆进行测序。,续上,根据测序峰图，鉴定出双拷贝敲除的单克隆,打靶效率经验参考,建立,knock-out,细胞系（双拷贝敲除）：,293T,，,hela,细胞：建系,成功率,100%,，目前成功建系,19,个,，打靶效率约为,30%-70%,，最短耗时,2,个月,ES/iPS,细胞：,建系成功率,100%,，目前成功建系,7,个,，打靶效率约为,20%-50%,，最短耗时,4,个月,数据统计至,2013.07,月,打靶效率经验参考,建立,knock-in,细胞系（单拷贝敲入）：,293T,、,hela,细胞等：建系,成功率,100%,，目前已成功建系,6,个,，打靶效率约为,20%-55%,，最短耗时,3,个月,ES/iPS,细胞：建系,成功率,100%,，目前已成功建系,2,个,，最短耗时,5.5,个月,，打靶效率约为,10%-28%,数据统计至,2013.07,月,应用实例,2,动物模型,斑马鱼,Zebrafish-gene A,WT,TALEN,580bp,Zebrafish-geneA(Kpn I),WT,TALEN,580bp,401bp,179bp,Genomic PCR,Restrictive enzyme digest,斑马鱼内,XX,基因敲除,结果反馈,我方设计,TALEN,识别序列；,提供最终的,TALEN,质粒,TALEN,质粒线性化；,体外转录,显微注射一细胞期受精卵,48h,后收集，抽提,10-15,个胚胎的基因组,DNA,，混合,PCR,扩增，酶切看结果,打靶效率为,80%,以上,应用实例,3,动物模型,小鼠,设计构建,TALEN,打靶载体,细胞水平,TALEN,活性检测,体外转录生成,mRNA,往受精卵,注射mRNA,嵌合体小鼠（,F0,）,F1 heterozygote,F2 homozygote,应用实例,3,动物模型,小鼠,leptinR Founders identification by T7E1 mismatch sensitive assays,sequences of TALEN-induced mutations in leptinR locus in different strains,应用实例,3,动物模型,小鼠,Leptin Receptor,TALENed F0 founder,WT littermate,C57BL6 strain,FVB strain,Leptin Receptor,TALENed F0 founder,WT littermate,斯丹赛部分成功案例,北京大学,张老师成功建立,人,ES,细胞某基因敲除系,北京大学,尹老师成功建立,人结肠癌细胞,某基因敲除系,长征医院,周老师成功建立,乳腺癌细胞,某基因敲入细胞系,清华大学,罗老师成功建立,小鼠,ES,细胞某基因,敲入系,中国科学院生物物理研究所,范老师成功建立,小鼠,MEF,细胞,某基因敲除系,中国科学院上海生化所,宋老师利用培训班拿到的平板直接建立,仓鼠细胞,某基因敲除系；,细胞建系成功案例,斯丹赛部分成功案例,华东师范大学,王老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率,30%,南京大学,官老师成功得到某基因敲除小鼠模型，打靶效率,12.7%,南方模式,费老师成功得到某基因敲除小鼠模型,华东师范大学,李老师成功得到某基因敲除小鼠模型,小鼠建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,中国科学院水生生物研究所,肖老师成功得到斑马鱼,F1,代杂合子，效率为,14/16,，并且后续得到,F2,代纯合子,复旦大学,姚老师成功得到斑马鱼某基因敲除的,F1,代杂合体,中国科学院健康科学研究所,荆老师成功的得到了斑马鱼突变体，打靶效率达,20%,；,华中科技大学,刘老师成功得到斑马鱼某基因敲除的突变体；,湖南师范大学,邓老师成功得到斑马鱼某基因敲除的,F1,代杂合体,F1,代中突变体的概率约为,30%,斑马鱼建模成功案例,斯丹赛部分成功案例,北京生命科学研究所,王老师成功获得,F0,突变体果蝇,珠海威康健生物科技有限公司,杨老师成功获得,F0,突变体果蝇,湖南师范大学,邓老师成功获得,F0,突变体果蝇,果蝇建模成功案例,TALEN,服务和产品,1.TALEN,试剂盒：,15,次,/30,次,/60,次。,2.TALEN,质粒构建服务：,1,）质粒构建,2,）质粒构建及细胞水平活性检测,3.,基因,Knock-out,或,Knock-in,细胞建系服务：,1,）,Knock-out,细胞系；,2,）,Knock-in,细胞系；,3,）点突变细胞系。,4.,基因,Knock-out,或,Knock-in,动物模型,5.TALEN,培训班,专业、完善的技术保障,保证客户得到高活性,TALEN,质粒并且最终建系,/,建模成功；,拥有强大的技术团体，提供全程免费的技术支持；,协助客户完善,TALEN,平台的构建；,若发生建系,/,建模失败，则全额退款。,培训地点,：上海市浦东新区蔡伦路,720,弄,301,室,培训时间,：,9:30-19:00,培训内容：,TALEN,技术相关讲座：,TALEN,技术介绍、发展与应用,TALEN,构建的实验室操作：根据设计好的,TALEN,序列 连接,TALEN,；,TALEN,技术疑难解答及讨论。,全国,TALEN,技术培训班,iPS,细胞建系及临床应用,Shinya,Yamanaka,(,山中伸弥,),John Gurdon(,约翰,格登,),2012,年,诺贝尔生理,医学奖获得者,研究进展,：干细胞是人体内可以转化为各种组织和器官的细胞，过去只能从胚胎中获得。,2006,年日本京都大学山中伸弥领导的实验室在世界著名学术杂志细胞上,首次,报道了诱导多能干细胞（,Induced Pluripotent Stem cells,，,iPS,）,技术,研究。,2007,年末，,Thompson,实验室和山中伸弥实验室几乎同时报道，利用,iPS,技术同样可以诱导人皮肤纤维母细胞,成为几乎与胚胎干细胞完全一样的,多能干细胞,。,2008,年,4,月，美国加利福尼亚大学科学家报告称，他们将实验鼠皮肤细胞,改造成,ips,细胞,，然后,成功使其分化成心肌细胞、血管平滑肌细胞及造血细胞,。,2009,年,2,月，日本东京大学科学家宣布，成功利用人类皮肤细胞制成的ips,细胞培育出血小板，而且从,技术上说用,ips,细胞培育人类红细胞和白细胞都是可能的,；紧接着，日本庆应大学科学家又宣布，成功用实验鼠的,ips,细胞培育出鼠角膜上皮细胞。,2009,年,3,月伊始，,ips,细胞研究便相继迎来两项重大突破。英国和加拿大科学家,发现了,不借助病毒、安全将普通皮肤细胞转化为,ips,细胞的方法,；美国科学家则在细胞杂志上宣布，他们可以将,ips,细胞中因转化需要而植入的有害基因移除，且保证神经元细胞的基本功能不受影响。,2009,年,7,月，,ips,细胞研究在临床应用道路上又迈出非常重要的一步。据英国自然杂志网站,23,日报道，,中国科学家周琪和高绍荣等人利用,ips,细胞克隆出活体实验鼠,，首次证明,ips,细胞与胚胎干细胞一样具有全能性。该成果让人们看到了,ips,细胞的实用性。,2010,年,7,月，巴西圣保罗大学医疗系的科研人员最近,通过,改造皮肤基因获取诱导多功能干细胞（,iPS,细胞）,的科研成果。,Oct4,Sox2,Klf4,C-myc,TALEN,技术,iPS,细胞,基因敲除,iPS,细胞,定点修复,iPS,细胞,定向分化,体外研究：疾病模型建立,;,发病过程研究,;,疾病机理研究,;,药物筛选,体内应用,再生医学,人类,iPS,产生流程,用于,iPS,建立的体细胞来源,皮肤成纤维细胞,骨髓来源的细胞,脂肪干细胞,肠上皮细胞,尿液细胞,-,无创！,毛囊间充质干细胞,。,一,切,体,细,胞,皆,有,可,能,！,iPSCs,临床应用,疾病模型,建立,疾病机理研究,细胞替代,疗法,发病过程研究,药物筛选,帕金森症,PD,脊髓性肌萎缩,SMA,镰刀形细胞贫血症,-1,抗胰蛋白质酶缺陷症,.,iPS,细胞系的临床应用,1.,疾病模型建立,1.,重编程设计,(Oct4,Sox2,Klf4,Myc),2.,定向分化,（,actin A,维甲酸，活化素,A,）,Virus,plasmid,protein,mRNA,Co-culture with stroma,Treatment with cytokines,神经元,心肌细胞,肝细胞,胰岛细胞,疾病模型,用于发病过程研究,More:,帕金森症,PD,脊髓性肌萎缩,SMA,早衰症,家族性缺陷自主症,FD,RETT,综合症,豹斑综合症,Long QT,综合症,Timothy,综合症,.,脊髓性肌萎缩,SMA,疾病模型,用于疾病机理研究,ips,细胞系,基因敲除的,ips,细胞系,不同组织,研究基因功能及和疾病的影响,TALEN,技术,定向分化,病人样本,APOB:,缺失降低,HCV,病毒的复制效率,SORT1,：降低肝细胞,ApoB,分泌；,影响脂肪细胞中葡萄糖转运；,介导运动神经元的死亡,AKT2,：调节肝细胞及脂肪细胞中的,胰岛素通路和糖代谢过程,PLIN1,：影响脂肪细胞中脂质分解过程,高通量筛选方法：对疾病的特征蛋白进行免疫荧光分析,（适用于某种蛋白表达发生明显变化的疾病，如阿兹海,默症、帕金森病、亨廷顿氏病、末期肌肉萎缩硬化症等）,疾病模型,用于药物筛选,AAT,缺陷症,2.,细胞替代疗法,定点修复,定向分化,基因突变型疾病,神经退行性疾病,ips,细胞系定向分化：细胞替代疗法,由病人,ips,细胞系定向分化得到的神经元细胞可显著改善小鼠的帕金森症状！,iPS,细胞系定点修复,利用,TALEN,、,ZFN,技术成功实现对,ips,细胞的定向修复！,定点修复后的,ips,细胞系经,定向分化得到正常细胞,！,iPS,细胞系定点修复,iPS,细胞系定点修复,修复后的,ips,细胞系定向分化得到的正常细胞可,提高疾病小鼠的生存率,！,iPS,技术服务及相关培训,iPS,相关慢病毒质粒构建及包装,人类胚胎干细胞建系,iPS,产生（小鼠、大鼠、人、猪、山羊、牛等）,疾病,iPS,产生（仅需提供病理组织的细胞样本）,iPS,细胞的鉴定,基因打靶及,ES/IPS,领航者,订购：,021-58950719,order,市场部：,021-58959719,market,技术支持：,021-38723968,service,