噬菌体课件.ppt

噬菌体概述,1,噬菌体展示技术,2,3,噬菌体载体,4,细菌的检测与治疗,5,噬菌体转导,第一章 噬菌体概述,分类,简史,概念,结构,特性,1.1,噬菌体概念,噬菌体是感染细菌、真菌、,放线菌、螺旋体等微生物的,病毒,，只能在,活的,微生物细,胞中复制增殖。,1.1,噬菌体概念,噬菌体,分裂中的大肠杆菌,大肠杆菌,电镜扫描图,附在细菌上的噬菌体,噬菌体,1.2,噬菌体发展简史,1896,年，英国细菌学家,Hankin,发现了水中存在抗细菌现象，并认为有种不明物质引起了这种现象。,1915,年，英国,Twort,在葡萄球菌中发 现噬菌体。,1917,年，加拿大人,F.d,，,Herelle,在法国巴斯德研究所又独立发现痢疾杆菌噬菌体。,1.3,噬菌体的特性,1,2,3,个体微小、可通过细菌滤器,无细胞结构专性细胞内寄生,分布广泛,1.3,噬菌体的特性,裂解或不裂解细菌,4,5,6,有抗原性可刺激机体产生抗体,能够抵抗热、低温、冰冻等,1.4,噬菌体结构,1.5,噬菌体的化学组成,核酸,：头部核心，,DNA,或,RNA,作用：噬菌体的遗传物质,蛋白质,：头部外壳和尾部,作用：保护核酸,构成外壳和尾部,1.5,噬菌体的化学组成,噬菌体的一些结构蛋白,1.6,噬菌体的分类,按照基本形态可划分为三类,：,蝌蚪状（,T4,）、微球状（,x174,）,和丝状（,M13,）。,根据噬菌体结构的不同可将其分为：,1,2,3,无尾部结,构的二十,面体,有尾部结,构的二十,面体,线状体,1.6,噬菌体的分类,迄今已知的噬菌体大多 数是有尾部结构的二十面体，到目前为止，研究者至少对,5568,种噬菌体进行了电镜观察，绝大多数,(,占,96.2%),为有尾噬菌体。,1.6,噬菌体分类,按遗传物质类型进行划分：,线状双链,DNA,（多数）,1.DNA,噬菌体：,环状单链,DNA,（少数）,线状单链,RNA,（多数）,2.RNA,噬菌体：,线状双链,RNA,（少数）,1.6,噬菌体分类,1.6,噬菌体分类,根据噬菌体与宿主的关系：,（,1,）,烈性噬菌体,：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体。,（,2,）,温和噬菌体,：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合到宿主的核,DNA,上，并且可以随宿主,DNA,的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。,1.7,噬菌体侵染细菌实验,烈性噬菌体侵染细菌的过程,（,1,）,吸附,（,2,）,注入,（,3,）,增殖,（,4,）,装配,（,5,）,裂解,1.7,噬菌体侵染细菌实验,1.7,噬菌体侵染细菌实验,噬菌体的侵染实验的结果,证明了,DNA,是遗传物质,1.7,温和噬菌体与菌细胞的作用,溶菌周期 溶原周期,第二章 噬菌体展示技术,1985,年,Smith,第一次,成功地将,Eco,RI,核酸内,切酶基因插入丝状噬菌,体基因,p,中,并在噬菌,体表面表达出了融合的,蛋白。,2.,噬菌体展示技术,噬菌体,Company Logo,？,噬菌体展示技术,2.1,噬菌体展示技术的发展,1988,噬菌质粒系统,1990,抗体片段的展示,1993,展示,cDNA,文库,1994,研发了,phage two-hybrid,技术,1996,首次体内,in vivo,淘选试验,1998,噬菌体展示载体作为基因导入载体,1999 Combination of phage display,with high-density arrays,2001 Automated phage display,selection,2.2,噬菌体展示技术的原理,以噬菌体或噬菌粒为载体，将目标蛋白的,DNA,序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面，通过筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体，并得到大量富集，从而获得目的多肽或蛋白质。,Company Logo,Lead,Hv,Link,Lv,E,PIII,PIII,基因型,表达型,融合蛋白,2.3,噬菌体展示技术流程,Company Logo,2.4,常用的噬菌体展示系统,常用的噬菌体展示系统,M13,丝状,噬菌体,T7,噬菌体,T7,噬菌体,噬菌体,T4,噬菌体,T4,噬菌体,2.5,噬菌体展示技术的优点,非展示系统 展示系统,2.5,噬菌体展示技术的优点,特定分子的基因型和其表型统一在同一个病毒颗粒内，将重组蛋白质筛选与基因筛选合二为一。,被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。,由于丝状噬菌体易于在大肠杆菌系统中分离扩增，因此此技术又合并了选择能力和扩增能力的优势，使得噬菌体展示技术成为高效的筛选体系。,操作简单易行，该技术采用经典的,PCR,分子克隆等技术即可操作，在几周内即可筛选,10,6,10,8,克隆，筛选获得抗体库可以用于原核系统表达，无需组织培养，极大地降低了成本。,筛选获得噬菌体随机肽库具有容量大、体积小、筛选简便、制备成本低、可多次扩增等突出优点。,2.6,噬菌体展示技术的局限性,所建库的容量和分子多样性受到限制；,不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达；,噬菌体展示文库一旦建成，很难再进行有效的体外突变和重组，进而限制了文库中分子遗传的多样性。,由于噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以，一些对细胞有毒性的分子如生物毒素分子，很难得到有效表达和展示。,2.7,噬菌体抗体库技术,它是在,PCR,技术和,Phage Display,的基础上实现的。把用,PCR,法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的,DNA,，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与,P,或,P,相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,2.7,噬菌体抗体库的分类,(1),根据 免疫抗体库,插入基,因片段 非免疫抗体库 天然抗体库,的来源 半合成抗体库,全合成抗体库,第一个合成的噬菌体抗体库是,Barbas,等,1992,年报道将合成的一小段,CDR3,片段。,Company Logo,2.7,噬菌体抗体库的分类,（,2,）按抗体基因的动物来源分类,鼠源性抗体库,人源性抗体库,驼源性抗体库,Company Logo,从抗体库中可筛选多种重要的抗体，如膜蛋白抗原、自身抗原、病毒抗原的抗体。这些显示出抗体库技术的应用潜力。,实例,Burmester,等构建了青霉素免疫单链抗体库；,Yuan,等从,7,个不同的人种,共,47,个健康人类的血液中提取基因,构建了人源天然单克隆抗体噬菌体抗体库,第三章,细菌的,检测,与治疗,噬菌体感染相应细菌后，迅速繁殖并产生子代噬菌体。,利用该特性可将已知噬菌体加入被检材料中，如,果,噬菌体效价增,强,，就证明,被检样品,中有相应细菌存在,。,应用此原理可以对细菌进行检测。,3.1,生物扩增法,原理：,当样品中的待检细菌数目较少时，将不利于噬菌斑的形成，影响检测结果。,如果加入,能够被噬菌体裂解,的辅助菌,，被侵染的待检细菌裂解释放出来的子代噬菌体会立刻,继续,吸附裂解辅助菌,，,从而形成清晰的噬菌斑。因此根据噬菌斑的数目检测样品中病原菌的含量,。,将待检细菌的噬菌体与样品混合，37,度培养,1h,，仅待检细菌被噬菌体吸附侵染,加入灭病毒剂灭活,5min,，灭活所有未侵染宿主细胞的噬菌体；,将辅助菌加入到样品中，中和灭病毒剂，并立刻混合后倒入,琼脂,平板进行培养,释放出来的子代噬菌体裂解辅助菌；平板中形成清晰可见的噬菌斑。,3.1,生物扩增法,该方法的关键是选择合适的灭病毒剂，其中化学试剂硫酸亚铁铵最为常用。利用该法已成功的检测出结核杆菌、沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和弯曲杆菌等。,3.2,荧光标记法,原理：,荧光标记检测技术是指利用荧光染料制备荧光噬菌体，利用这种噬菌体的荧光特性来检测病原菌的方法。,以食源性沙门氏菌的检测为例,鸡蛋中检测到的沙门氏菌方法,荧光标记,O-I,噬菌,体的制备与收集,荧光标记的,O-I,噬菌体侵染宿主菌,荧光显微镜,观察结果,O-I,噬菌体液与,1,SYBRR,染料，按,10,1,的比例混合,摇匀,在暗处作用,10 min,0.2,m,过滤,收集荧光标记的噬体,1,PBS,缓冲液冲洗,23,次除去标记噬菌体后多余的染料,最后去离子水洗涤滤膜回收噬菌体,将待检样品于,37,静止培养,6 h,预增菌,后，加入,荧光标记的,O-I,噬菌体暗处侵染,20min,，,加入,4%,多聚甲醛终止反应,，,0.2,m,滤膜过滤收集,沙门氏菌阳性者均出现明显的杆状,荧光，,即带有荧光标记的沙门氏菌,。,检测结果,荧光标记噬菌体O-I,对食品样品检测结果,沙门氏菌,O-I,噬菌体,3.3,与生物传感器联用检测方法,原理：,根据,具有专一裂解特点的烈性噬菌体能够将特异性的细菌裂解释放出胞内物质（如酶），通过生物传感器监控细菌胞内某种物质的信号变化，即可检测出致病菌,。,利用这种方法可以在,6,8h,内检测出,1CFU/100mL,的大肠杆菌。,与生物传感器联用的噬菌体检测技术操作简单、分析速度快，但由于生物传感器抗干扰能力差、可靠性低，生物传感器在病原体检测中的应用,受到一定的限制,。,3.4,应用报告噬菌体法检测致病菌,原理：,应用,DNA,重组技术将报告基因首先插入到噬菌体,DNA,上，将带有报告基因的噬菌体与待检样品作用，随着报告基因在宿主菌中,的,表达，目标菌体便可快速得到检,测,。,含有报告基,因的噬菌体,宿主菌,常用的报告基因有：,绿色荧光蛋白基因,(gfp),2,细菌荧光素酶基因,(lux),1,-,半乳糖苷酶基因,(lacZ),3,带有荧光素酶基因,(lux),的噬菌体在体外不发光，但当该噬菌体吸附侵染宿主细菌后，发光基因得以表达，因此，噬菌体在宿主细胞体内可以发光。,含有,gfp,基因的噬菌体侵染特定的宿主菌后，该基因在宿主菌中表达并产生绿色荧光蛋白，再用荧光显微镜观察即可检测待检样品中有待检菌。,检测实例,E.coli,用以上三种基因,均可,进行检测,噬菌体治疗,噬菌体对一些细菌,具有高度的专一性,当,噬菌体侵染细菌时,可,在细菌中繁殖并杀死,细菌,;,而它对动植物没,有毒性。根据噬菌体,的这一特性可对细菌,性疾病进行治疗,。,早期噬菌体治疗,1917,年,加拿大微生物学家,Herelle,在田野中进行了噬菌体治疗鸡沙门菌感染的研究,，并获得了成功。,1919,年,1921,年,Herelle,在巴黎医院给一个患有痢疾的男孩实施抗痢疾噬菌体治疗,治疗后病人的症状消失并康复,。,Bruynoghe,和,Maisin,将,噬菌体注射到外科手术伤口部位,治疗了葡萄球菌的感染。,噬菌体治疗感染的近期研究,3,例确诊为结核性口腔溃疡患者采用分枝杆菌噬菌体软膏涂抹，均在,1,周内开始愈合，,2,4,周全部愈合。,刘晓彬等应用噬菌体治疗肠源性铜绿假单胞菌感染的动物模型，有明显的治疗作用。,Matsuzaki,等采用噬菌体,MR11,治疗金黄色葡萄,球菌的感染。,噬菌体治疗范围,噬菌体治疗敏感性致病菌的范围相当广泛，如葡萄球菌属细菌、埃希菌属细菌、克雷伯菌属细菌、变形杆菌属细菌、假单胞菌属细菌、弧菌属细菌、放线菌属细菌、分枝杆菌属细菌等。,治疗的疾病包括化脓性伤口感染、胃肠炎、脓毒症、骨髓炎、皮炎、脓胸、肺炎、脑炎、细菌性腹水、痢疾和霍乱等。,噬菌体制剂,活噬菌体制剂,1,噬菌体尾部样细菌素,1,裂解酶制剂,2,是双链,DNA,噬菌体在自身复制晚期合成的一类细胞壁水解酶,，,能作用于细菌细胞壁的肽聚糖,破坏细菌保护层,所以可作为起杀菌作用的治疗药物,。,是由噬菌体的碎片组成的高分子质量颗粒,它能消除目标菌，从而达到治疗的目的，可由许多来自肠杆菌科和其他革兰氏阴性细菌的噬菌体产生。,噬菌体治疗较抗生素治疗,的优势,噬菌体呈指数增殖，自我复制能力大，每一个裂解周期均能产生大量子代噬菌体,细菌很难对噬菌体产生耐药性,噬菌体药效持续时间长,准确选择相应的噬菌体也可作为预防用制剂,噬菌体获取比较方便，价格比较低廉,研制开发的周期短，成本低,噬菌体治疗的不足,噬菌体的宿主范围有限,噬菌体治疗的不足,免疫源性：,噬菌体作为动物体的异源物质，会刺激机体产生免疫反应，产生的抗体可能抑制噬菌体使其失去侵染敏感细菌的能力，限制其抗菌作用。,噬菌体治疗的不足,噬菌体,可释放一些毒素,编码大肠杆菌,O157,的毒力基因,stx1,和,stx2,可以导致发炎反应和提高致病性。,噬菌体治疗的发展趋势,扩大噬菌体谱,改造宿主菌的裂解方式,开发,噬菌体抗感染药物,发展趋势,大多数噬菌体都是专一性的对某种细菌起作用，治疗范围受限，我们可以通过基因工程技术将多种噬菌体吸附宿主菌的关键基因转化入同一噬菌体中并使之表达，从而产生一种可以对多种细菌同时具有裂解作用的新噬菌体。,噬菌体,通过,holin,蛋白和细胞内溶素两种物质造成细菌裂解。,通过对产生这两种物质的基因进行改造，,改造后的噬菌体具有高效杀死细菌的能力。,目前美国,4,家公司正试图研制针对一些重要的病原菌,如耐万古霉素肠球菌,(VRE),、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,(MRSA),和食物传播的病原菌,(,沙门菌,),的噬菌体。,Phage Ther-apeutics,公司抗葡萄球菌制品已配制完成,其制造工艺已获,FDA,批准。,。,有的噬菌体基因组较大，可将外来目的,DNA,替代或插入到噬菌体基因组的某些序列中，使目的,DNA,随噬菌体的繁殖而大量复制和表达。,第四章 噬菌体载体,噬菌体载体分类,1,噬菌体,载体,噬菌体载体,P1,噬菌体载体,M13,噬体,cos,载体和噬菌粒,噬菌体颗粒中,的,DNA,是一线性,双链,DNA,分子，长,48 502bp,，两端,各有,12,个碱基的,5,凸出黏性末端,是互补的。进入,细胞的,DNA,通过,两端的黏性末端环化。,噬菌体,2,噬菌体性质与用途,在,DNA,分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源,DNA,酶切片段的克隆,能承载比较大的外源,DNA,片段，约,23kb,左右,用途,:,主要用于,cDNA,文库构建和外源目的基因的克隆。,2,噬菌体基因图谱,3,噬菌体载体的构建,切去,DNA,上,部分非必需的,区域和多余的,限制性核酸内,切酶切割位点,插入可供,选择的标,记基因,2,1,建立,噬菌体,体外包装系统,3,基本策略,4,DNA,载体的构建,缩短长度 插入型载体,插入位点,体外包装,载体长度,37,kb,插入片段大小：,0-14,kb,（51 37）,插入片段,体外包装,噬菌体克隆载体的主要类型,插入型载体,DNA,载体的构建,载体长度 26,kb,插入片段,最小装载长度 10,kb,（36 26）,体外包装,体外包装,插入片段,最大装载长度 25,kb,（51 26,）,噬菌体克隆载体的主要类型,替换型载体,噬菌体标记基因,重组体：正常生长,非,重组体：不生长,重组体：白色的噬菌斑,非,重组体,:,蓝色的噬菌斑,重组体：清晰型透明斑,非,重组体,:,浑浊型噬菌斑,cI,基因,lac Z,基因,red gam,基因,重组体：清晰型透明斑,非,重组体,:,浑浊型噬菌斑,cI,基因,噬菌体载体克隆,DNA,片段步骤,构建,噬菌体基因组文库的步骤,构建,噬菌体基因组文库的步骤包括,:,获得含基因的,DNA,片段,与,噬菌体克隆载体重组,转化受体菌,和,筛选克隆子,噬菌体载体的应用,实例,1,吉林大学的韩俊友博士应用噬菌体载体,TripIEx2,构建了牛蛙皮肤,cDNA,文库,为进一,步研究牛蛙皮肤组织抗菌肽奠定基础。,噬菌体载体的应用,实例,2,中山大学的李艳雯教授应用噬菌体载体,TripIEx2,构建了大肠癌细胞,cDNA,表达文库,该文库包含了大肠癌,HRT18,细胞株所有的肿,瘤抗原,cDNA,，使得获得大肠癌肿瘤抗原基因,更加容易。,噬菌体载体的应用,实例,3,刘运洪等人利用噬菌体载体,pC0mb3XS,通,过噬菌体展示技术构建抗人,VEGFRZ,（血管,内皮生长因子受体）噬菌体抗体库。为抗肿,瘤治疗研究奠定了基础。,Section 5 Transduction,Application transduction is a common tool of bacterial genetics reseach.It can be used to transfer genes between bacteria,complementary tests,and gene mapping,in particular analysis gene structure through gene transduction,应用转导是细菌的遗传学研究中的一种常用研究手段。它可以用来在细菌间转移基因，进行互补测验，进行基因定位，特别是通过共转导方法进行基因的精细结构分析。,Section 5 Transduction,Transduction,：,In the process,The bacteriophage as a media,the bacterial gene is transducted into other bacteria.,转导：以噬菌体为媒介，将细菌基因导入另一细菌的过程。,Generalized transduction,Bacteriophages infect bacterium,Bacteriophages replicate in the bacterium,host DNA break,bacteriophage assemble protein shell which host DNA fragmentation is in it,Bacteriophage with host gene infects the recepient bacteriaum,Generalized transduction,The original host DNA fragments occur exchange reorganization with recepient,bacterium,Assemble protein shell,3,Generalized transduction,The use of,generalized transduction,It can transduct any,part of the bacterial,genome,Bactriophage infect donor bactium,Bactriophage repication,Bactriophage,assemble,Bactriophage,infect,Homologous recombination,Specialized transduction,Specialized transduction,Lysogenic prophage loses its dormant state and excised from the host DNA.Rarely the excision process is inaccurate,the phages carry and transfer host genes between bacteria,结合态噬菌体切离宿主,DNA,，携带部分宿主基因，再次侵染时与受体菌,DNA,同源互补及交换重组。,Specialized transduction,Specialized transduction,In genetic engineering,we can put the cloned gene into the,phage DNA by recombinant DNA technology,and then wrap it in the phage coat protein,go to infected host cells in order to prepare genomic library.,在遗传工程中可以把所要克隆的基因通过重组,DNA,技术插入到,噬菌体的,DNA,中，然后通过离体包装方法把它用噬菌体外壳蛋白包装起来，再去感染寄主细胞以制备基因文库。,The example of transduction,Victor Ravin complished the effective plasmid pX3 transduction in,Lactobacillus delbrueckii,(,德氏乳杆菌,),by bacteriophage LL-H,The method,Preparation of plasmid transformants of,L.delbrueckii,LKT,Purication of phages and their DNAs,The restriction endonuclease digestions and agarose gel electrophoresis of DNA samples,blottings,and hybridizations were carried out,Transduction,Results,The bacterial cells of ATCC 15808 were infected with purified phages propagated in the plasmid transformant strains LKT(pX3)or LKT(pJK650),Negative controls convinced that no viable LKT(pX3)transformant cells were present in LL-H(pX3)or LL-H(pJK650)phage preparations used for transduction.,Phage LL-H transduced plasmid pX3 from,strain LKT(pX3)to each of all five tested,L.delbrueckii,strains at very high frequency:from 0.1 to 1.,The high frequency of plasmid transduction obtained in this study is not a consequence of either plasmid pX3 or phage LL-H alone,but is a result of specific interaction(s)between plasmid pX3 and phage LL-H.,Thank you!,