杀菌剂抗药性.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2013/1/12,#,杀菌剂抗药性,主要内容,植物病原菌对杀虫剂的抗药性,杀菌剂抗药性生理机制,杀菌剂抗药性遗传机制,抗药,菌的分子检测技术,植物,病原菌对杀菌剂的抗药性,简称植物病原菌抗药性或杀菌剂抗药性。它指的是病原菌群体本来,对药剂,是敏感的,但是由于突变等原因,出现了灵敏度显著降低的现象。,联合国粮农组织,（,FAO,）,对,杀菌剂抗药性,推荐的定义,是“遗传学,为基础的灵敏度,降低,”,。,交互,抗药性与负交互抗药性,交互抗药性,是指植物病原真菌对一种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过但作用机制相似的药剂也产生了抗药性的现象。与交互抗药性相反，,负交互抗药性,是指植物病原真菌对某种杀菌剂产生了抗药性，而对另一种从未使用过的药剂敏感性更强的现象。交互抗药性和负交互抗药性在同类或不同类的杀菌剂之间普遍,存在,。,杀菌剂抗药性生理机制的主要类型,对杀菌剂通透力的下降,病原菌细胞膜通透性的改变，可以导致杀菌剂不能进入病原菌而达不到其作用位点，从而杀菌剂无法发挥其杀菌剂作用。如稻瘟病对稻瘟散的抗药性。,提高对杀菌剂的钝化能力,某些病原菌可以把进入体内的杀菌剂转化为毒力较低的化学物质，从而使杀菌剂对它的毒性降低。也就是通过部分的解毒过程，来提高其抗药能力。,降低转毒能力,降低杀菌剂与其作用点的亲和力,病原菌可以改变自身杀菌剂作用点的结构等，使杀菌剂对该作用位点的亲和力下降，从而使杀菌剂无法发挥其杀菌作用。,去,毒性,病原菌在其体内可以通过一系列代谢过程将有毒的杀菌剂转化成无毒物质，从而使杀菌剂失去杀菌作用。,多菌灵,构巢曲霉,-,微管蛋白,形成保护性代谢途径,所谓形成保护性代谢途径，就是改变原代谢途径中的某一环节，使药剂不能通过作用点，从而避免药剂的杀菌作用,。,如,抗霉素,A,是作用于,呼吸链中细胞色素,b,、,c,间电子传递,的，而对抗霉素,A,有抗性的玉蜀黍黑粉菌菌株改变了呼吸链中细胞色素,b,、,c,间电子传递链的一段代谢环节，在细胞色素,b,前面改用了另一个旁路的末端氧化酶。,高速,排泄杀菌剂,杀菌剂,抗药性,遗传,机制,的主要类型,植物,病原菌的抗药性可以由染色体基因活胞质遗传基因的突变产生。因此，可以将植物病原菌的抗药性分为,核基因,（,nuclear gene,）,控制的抗药性和,胞质基因,（,cytoplasmic gene,）,控制的抗药性。,胞质基因控制的抗药性,目前已知大多数细菌的抗药性基因主要存在于,质粒,DNA,分子,中，许多药剂如萎锈灵尽管是干扰真菌线粒体活性，抗性却是由核基因控制的，过去仅发现酵母对三烷基锡,（,trialkyltin,）,类药剂（干扰病菌的氧化磷酸化）的抗药性是由线粒体,DNA,分子控制的，但近年来来研究发现病原真菌对作用于,菌体细胞色素,bc,1,复合物,QoIs,类药剂,的抗药性也是由线粒体基因控制的。,铜制剂,（,copper,）,链霉素,（,streptomycin,）,抗性,在苹果疱斑病菌,(,Pseudomonas syringae pv,papulans,),和辣椒疮痂病菌中，,链霉素,抗性基因主要存在于质粒中。,Chang,等对寄生疫霉,(Phytophthora parasitica),的研究表明，链霉素抗性也是由胞质遗传因子决定的，属母性遗传。,QoIs,类药剂,（,Qo respiration inhibitors,）,Qols,类杀菌剂是一类作用于病原菌线粒体,中电子传递链,上,cytbc1,酶复合物,Qo,中心的一类,药剂,，主要包括,甲氧丙烯酸酯类,和,噁,唑,烷酮类药剂,。与,大多数药剂不同，这类药剂的作用靶标,cytbc1,是,由线粒体,DNA,编码的，而不是,由核,DNA,编码的,。,核,基因控制的抗药性,主效基因,（,major-gene,）,微效,多基因,（,poly-gene,）,单,基因抗性,(single-gene),多基因抗性,（,multi-gene,）,复等位基因抗性,（,multiple allelic resistance,）,该基因座位上不同的碱基位点可以分别发生突变，并能使病菌表现出不同的抗性水平,抗性由多个微效基因控制，且这些基因间具积加效应，即单个或少数基因的突变引起的抗性水平是微不足道的,种类,代表性药剂,杀菌机制,病原菌抗药机制,苯并咪唑类,多菌灵、苯来特、特克多和甲基托布津,结合病菌的,-,微管蛋白，阻碍细胞的正常有丝分裂,-,微管蛋白的,192-202,个氨基酸发生基因突变,二甲酰亚胺类,乙烯菌核利、速克灵、菌核净和扑海因,自由基介导的细胞毒假说,双组分组氨酸蛋白激酶,N,端的,6,个,90,氨基酸重复区发生突变,有机磷类,磷酰胺类：定菌磷,抑制真菌对氧分子的吸收,不常见,硫代磷酸酯类：稻瘟净、异稻瘟净和克瘟散,破坏菌体生物膜的结构,裂解药剂,“S-C”,键以致失去生物活性；,可能与药剂靶点修饰或细胞膜透性改变有关,苯酰胺类,甲霜灵、苯霜灵、恶霜灵和甲呋酰胺,干扰核酸的合成,单基因变异,甾醇生物合,成抑制剂类,DMIs,：三唑类、咪唑类和嘧啶类,抑制甾醇,14-,脱甲基酶,P450,的活性,ABC,运输体基因过量表达，将,SBIs,杀菌剂泵出病原菌；,CYP51,基因发生点突变或表达水平的上升；,14,还原酶的过量生成或对药物亲和性的降低；,菌体通过代谢解除,DMIs,杀菌剂的毒性,8,7,异构酶及,14,还原酶抑制剂：吗啉类和哌啶类,抑制,8,7,异构化酶或,14,还原酶的活性,甲氧基丙,烯酸酯类,嘧菌酯、醚菌酯、苯氧菌胺和肟菌酯,干扰病原菌能量的合成,细胞色素,b,基因发生突变,苯并咪唑类,苯并咪唑类benzimidazoles,）,化合物是上世纪,60,年代后期开发的一类非常重要的药剂，被广泛应用于农用杀菌剂、兽药及临床抗癌药物。,苯,并,咪唑类药剂对大多数子囊菌、半子囊菌和担子菌引起的病害均有防治效果，又因为该类药剂被首先发现具有植物内吸性，对病害有治疗意义，该类药剂的开发被认为在植物病害化学防治上具有里程碑式的意义。,苯并咪唑类化合物的母体结构中都具有一个苯并咪唑的活性基团，只要品种有,多菌灵,（,carbendazim,）,、苯菌灵,（,benomyl,）,、噻唑灵,（,thiabendazole,）,、麦穗宁,（,fuberidazole,）,等，另外由于,甲基托布津,（,thiopanate-methyl,）,在生物体中主要代谢为多菌灵而起作用，因此也将其归入这类化合物。,该,类药剂主要作用于,病原菌的,-,微管蛋白，,防止纺锤,丝的形成，从而干扰,细胞分裂。,苯并,咪唑类杀菌剂,高抗药性风险,作用靶标单一，病原菌很容易发生抗药性突变。,有很好的杀菌活性和较宽的防治谱，在过去一段时间内被大量单独使用，已在自然界形成很高的选择压力。,大多数病菌对这类药剂的抗药突变体通常适合度较高，有较强的生存竞争能力。,1969,年，,Schroeder,等就首次报道了黄瓜白粉病菌产生对苯菌灵的抗药性。到,1987,年止，至少有,55,个属的植物病原菌对这类药剂产生了抗药性。,Jung,和,Oakley,检查了苯菌灵抗性突变区域在不同生物体间的保守度,第,6,位,His,和第,198,位,Glu,是高度保守的。第,165,位上差异大，但所有的真菌均为,Ala,。真菌中第,200,位，,Thy,代替,Phe,导致了对苯菌灵的抗性。,Fujimura,研究了对多菌灵产生抗性的脉孢霉菌株,突变连锁于编码,-,微管蛋白的,Bm1,位点；第,198,位不同氨基酸代替导致不同程度的敏感性。,165167,、,237250,位控制该类杀菌剂与乙霉威的正交互抗性。,G.Zeae,和,G.pulicaris,抗性菌株的,-,微管蛋白基因病没有发生改变，说明在不同病菌中或者在镰刀菌中对该类药剂发生抗药突变的位点不同。,目前所获得的多种具有对苯并咪唑类杀菌剂田间抗药性的植物病原菌菌株中，氨基酸突变仅仅出现在两个位点：,198,和,200,。在人工诱变的抗药突变体中除上述位点外还涉及到其他一些位点如,165,、,257,等位点氨基酸的改变。,一般来说,，不同微生物对苯并咪唑类杀菌剂产生抗药性的分子生物学机制，只要由,-,微管蛋白结构基因上,196,202,个氨基酸基因的突变所致。这类突变导致了,-,微管蛋白的三维构象发生变化，从而阻止了药剂与,-,微管蛋白的结合，使病原菌产生抗药性。,大多数病菌对苯并咪唑类杀菌剂的抗性是由单个主效基因,-,微管,蛋白控制的，且该基因的不同碱基发生或同一碱基发生不同的突变可以使病菌对药剂产生不同的抗药性水平。,芳烃类药剂,（,aromatic hydrocarbon group,）,芳烃类药剂主要包括,地茂散,（,chloroneb,）,、五氯硝基苯,（,quintozene,）,、甲基立枯磷,（,tolclofos-methyl,）,、二甲基酰亚胺类,（,dicarboximides,）,以及吡咯苯类,（,phenylpyrroles,）,杀菌剂等，由于这些药剂具有交互抗性，且都对病菌又死分裂有不同程度的影响，因此将它们都归入芳烃类进行讨论。,二甲酰亚胺类杀菌剂,二,甲酰亚胺类杀菌剂,（,dicarboximide fungicides,DCFs,）,，如乙烯菌核利,（,vinclozolin,）,、菌核净,（,dimethachlon,）,、速克灵,（,procymidone,）,和扑海因,（,iprodione),等是,20,世纪,70,年代初推出的一类广谱、触杀型、保护性杀菌剂，也有一定的治疗作用,。,使用时间延长,施,用量加大,杀菌,谱广,真菌,对该类杀菌剂的抗药机制，还没有得到确切的结果。目前，研究者们普遍认为是这些病原真菌细胞内的,双组分组氨酸蛋白激酶,N,端的,6,个,90,氨基酸重复区的突变,介导着对该类杀菌剂的,抗药性,。,双,组分组氨酸蛋白激酶结构示意图,根据,抗药菌株同时具有对渗透压敏感的,特征，,研究者们克隆了很多真菌的双组分组氨酸蛋白激酶基因，并且发现：抗药菌的,N,端,6,个,90,氨基酸重复区中存在着碱基的突变或缺失，从而造成氨基酸或开放阅读框的改变，所以该氨基酸重复区的突变可能是抗药性产生的,原因。,但植物病原真菌对,DCFs,产生抗药性的机制，还需要更进一步的研究。,甾醇生物合成抑制剂（,SBIs,）,作用于病原菌甾醇生物合成过程中的,C-14,脱甲基酶，称为甾醇,C-14,脱甲基抑制剂，简称,DMI,类,（,demethylation inhibitors,）,药剂。,包括,三唑类,(triazoles),、咪唑类,(,imidazoles,),、,嘧啶,类,(pyrimidines),、吡啶类,(pyridines),、哌嗪,类,(,piperazines,),。,8,7,异构酶及,14,还原酶抑制剂。它们作用于病原真菌的机制是通过模拟反应的碳正离子过度态，竞争性地抑制异构化酶或还原酶的活性。,包括吗啉类,（,morpholines,）,和哌啶类,(piperidines),。,抗药菌的分子检测技术,等位基因特异性扩增,(,Allele,-,Specific Amplification,ASA,),由于,PCR(,Polymerase Chain Reaction,),过程中引物延伸是,3,端,开始的,所以,3,末端,的碱基对引物的延伸至关重要。因此在引物,设计中,根据已知突变位点在引物,3,端或中间设计一,个错配,碱基,使之仅能与敏感型或抗药型互补而只,扩增,相应的敏感或抗药性基因。也可以将多个引物,在一,个反应体系中进行,(,多重,ASA,),其产物通过,毛细管电泳,完成多个点突变的检测。,油菜菌核病菌,Sclerotinia sclerotiorum,对,多,菌灵,(,carbendazim,MBC),产生,抗药性,：,198,位,Glu(,GAG,),点突变为,Ala(GCG,),S-TR/SS-1 373bp,片段核酸,的菌株即为,MBC,HR,(,EC,50,100 ug/mL,),；,无扩增条,带的菌株为,MBC,S,(EC,50,1 ug/mL,),;,S-TS/SS-1 373bp,片段,核酸的是,MBC,S,无扩增,条带的为,MBCHR,菌株,。,因此,通过,ASA,方法,能,直接,鉴别,MBC,HR,和,MBC,S,菌株。,等位基因特异性扩增,(Allele,-,Specific Amplification,ASA),限制性片段长度多态性,(,Restriction,Fragment,Length,Polymorphism,PCR-RFLP,）,S,.,sclerotiorum,的,MBC,HR,菌株,-,微管蛋白,基因,第,197,位密码子,GAC,与,198,位,密码子,GCG,形成,一个,Tha,I,限制性,酶切位点,(CGCG,),，因此,只有,MBC,HR,菌株才能,被,Tha,I,酶切,MBC,S,菌株,则不被酶切。用引物,B1/B3,扩增,出一段,874 bp,的,片段,用,Tha,I,酶,切后,MBC,HR,菌株,的核酸可产生,193 bp,和,681 bp,两,个,片段,而,MBC,S,菌株只有一条,874,bp,片段,。,单链构象多态性,(,Single,-,Strand Conformation,Polymorph ism,SSCP,),在,不含,变性剂,的,中性,聚丙烯酰胺凝胶,中,单链,DNA,的,迁移率除与,DNA,长度,有关外,更,主要决定于,DNA,单链,所形成的空间,构象,相同,长度的单链,DNA,因,其顺序不同或单个碱,基差异,所形成的构象就会不同,。,应用电导仪测定番茄灰霉病菌对多菌灵抗药性,电导率法是衡量溶液中离子强度高低的一个特征参数，它与细胞中变化较大的组份,诸如,RNA,、,DNA,、氮或碳的含量无关，而与溶液中的,离子浓度,有关。,溶液：多菌灵盐酸溶液,对象：菌丝,谢谢！,