细胞生物学实验-细胞培养.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,实验目的：,实验课是培养同学们独立工作和为了开展生物学及遗传研究工作打下基础，因此每位同学必须认为认真进行实验，发挥独立钻研的精神。但是遇到困难一定要及时向指导老师提问清楚。,学习和掌握昆虫细胞培养的操作技术，熟悉实验室的基本规则。为今后深入研究打好基础。,掌握实验室一些仪器的操作方法。,实验结束后提交规范的实验报告。（含照片和电子文档）,实验要求,：,进实验室先,洗手、签到,。进细胞培养室要换鞋。,必须保持显微镜、试验桌、超净台以及其它用具的清洁和整齐，各种药品、试剂按照规定的用量进行使用。用完后要,恢复摆放位置,。,严格遵守显微镜使用的注意事项，否则损坏物镜，同时也影响试验的进行。,离开实验室前，必须检查水龙头和电开关，避免发生事故。,实验原理：,Sf-9,注释：Sf-9细胞是由G.E.Smith 和 C.L.Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。,Sf-9是半贴壁的细胞，贴壁性不强。,Sf-9细胞的形态,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要,2 细胞的生存环境,温度:28,O,2,pH:7.2-7.4,渗透压,3 无污染,4 无毒,培养液：Graces Antheraea 培养液4保存。完整培养液在使用前加入10%热灭活的胎牛血清。,是属于人工合成培养基。,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,血清中含有：,多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）,多种金属离子,激素；,促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。,各种生长因子,转移蛋白,不明成分,血清质量好坏是实验成败的关键。,常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。,优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。,血清的灭活（消除补体活性）：,56 ，30 min,血清的消毒：过滤除菌,培养基的配制,（,以配制,RPMI-1640培养基为例,）,RPMI-1640培养粉 1袋,碳酸氢钠 2.0 g,青、链霉素 各100单位毫升,加三蒸水 至 1000ml,过滤除菌。,调节pH值至7.2,加血清（终浓度 10）,通常用的培养基为Grace培养基，,添加3.3g/L 水解乳蛋白,3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。,用于高效表达外来蛋白制品。,实验材料：,实验用品：,超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸,生化培养箱,倒置显微镜,酶标仪、微孔板震荡器,液氮,罐,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：,湿热消毒用途广,电热干燥箱：,干热消毒（160 ，2小时）。主要用干玻璃,器皿消毒,滤器：,过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、,酶液等均采用滤过法除菌,超净工作台：,为细胞操作提供无菌环境,紫外灯：,紫外线消毒。主要用于培养室,空气、操作台、塑料,培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃粒，使空气得到净化。,净化空气徐,徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,生化培养箱,生化培养箱设定的条件为28 。,使用生化培养箱培养细胞时应注意的问题：,1）保持培养箱内空气干净。定期消毒,（90 ，14 h)。,2）箱内灭菌蒸馏水3000ml蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,倒置显微镜,培养瓶,拿培养瓶的正确姿势：拇指和食指夹住培养瓶，瓶口向外，中指托住瓶底。保持瓶子的水平，防止培养液倒向瓶口。,常用玻璃器皿清洗,冲洗、浸泡（自来水）、酸泡（24小时）、刷洗（洗衣粉）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,高压消毒。,清洁液的配制,实验步骤：,1、细胞培养室的环境,细胞生长要求严格的无毒无污染环境，因此必须注意培养室的清洁卫生，保持操作空间的无菌条件：,1）培养室应为独立、封闭的空间。培养室和缓冲间都应保持整洁，不要随意进出。,2）保持超净工作台的无菌环境，每次使用前打开紫外灯照射消毒1530min；每次用完后将废弃物清理干净，各用具规放整齐，用75%酒精擦净台面，再打开紫外灯照射30min以上。,3）定期擦洗桌面，地板、清洁培养室，并用0.1%的新洁尔灭溶液消毒；定期打开培养室的大紫外灯，将整个房间进行照射消毒。,4）每次打开培养箱前，或者伸入超净工作台进行操作前，均用75%的酒精擦手。,5）定期整理冰箱。将药品试剂分类摆放，过期或者被污染的试剂应及时清除。,6）定期清洁培养箱。,2、细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。,细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序：,当温度在-25 以上时，12/min,当温度达-25 以下时，510/min,当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器,简易程序：,将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以,线绳，通过线绳将,纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。,（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。,（3）低速离心10分钟。,（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,2、Sf9细胞的传代：,判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。,一般来说，原代培养物未达到生长基质的80%表面面积，不要急于传代，对于拟行首次传代的培养物更如此。,Sf9的分裂周期大概是27小时左右,Sf9传代的方法：,1）吸取或者倾出旧培养液。,2）加入一定量的新培养基，用吸管吸取培养液，反复吹打瓶皿底壁，使半贴壁的细胞脱离瓶皿底壁。,吹打过程须有序进行，亦即要从一边开始到另一边结束，尤其是器皿的边缘地带和四角处，确保瓶皿底壁各处的细胞均被吹打脱离。吹打时动作不宜过猛，吹出液体的力度要适中，否则会直接损伤细胞并产生能伤害细胞的气泡。或者使细胞碎片增多。,经吹打后，得到细胞悬液。,3）接种在新的培养瓶皿内。一般接种两个或者多个培养瓶皿内。,有时候，传代仅为了使培养物经历并适应传代处理过程，在培养物细胞数量不大的情况下，传代时还只是接种在一个培养瓶皿内。加入培养液。（平时不做实验时，只需要传一瓶）。,（以1：5或更多为宜，每2-3天传代一次）28培养（不用CO2培养箱）。,4）送入培养箱中继续培养。,细胞培养换液,对于像sf9这样的半贴壁的培养物，可按如下步骤操作,：,吸去或倾出（部分或全部）旧培养液。,加入新鲜的培养液。加入的量与换液前的量相同。,放回原来的培养箱中继续培养。,