第七章-制作课件-抗原抗体反应及应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,2001 免疫学信息网 ,基本内容,第一节抗体的制备和应用,第二节抗原抗体反应的应用,第一节 抗体的制备,抗血清的制备,单克隆抗体的制备,基因工程抗体的制备,抗体的制备,抗体种类：,第一代抗体,多克隆抗体,（polyclonal antibody),第二代抗体,单克隆抗体（monoclonal antibody),第三代抗体,基因工程抗体（genetic engineering antibody),细胞性抗原：,（1,2）10,7,/只，不加佐剂，2,3周重复一次,可溶性抗原：,首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3,6周100,200微克抗原，融合前3天，加强免疫,（一）免疫小鼠,动 物：,BALB/c小鼠,712周龄,20g25g体重,（二）骨髓瘤细胞筛选标准：,1.瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌。,2.是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（,HGPRT,）和胸腺嘧啶激酶（,TK,）的缺陷型。,（三）细胞融合,细胞融合剂：,PEG:,分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂,作用机理：,诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合,作用特点：,随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同,HAT培养基：,H（Hypoxanthine）:,次黄嘌呤,A（Aminopterin）：,氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径,T(Thymidine)：,胸,腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA,骨髓瘤细胞,:,HGPRT-，TK-;死亡,脾细胞:,HGPRT+，TK+;,短命(3天),杂交瘤细胞:,HGPRT+，TK+;,长命,骨髓瘤细胞、脾细胞与,杂交瘤细胞,杂交瘤细胞：,长期生长繁殖,利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA,从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息,从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力,饲养细胞：,细胞密度过低不利于细胞生长繁殖,常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞,其中MQ还有清除死亡细胞的作用,饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞的纯化,。,饲养细胞,特点：,不需任何特殊设备,克隆出现效率高,实验室常用方法,方法：,细胞悬液通过系列稀释,每个培养孔含1个细胞,有限稀释法,（四）阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化,单克,隆抗,体的,扩大,生产,腹水制备,大瓶培养,中空纤维反应器,优点：,在体外“永久”地存活并传代,用相对不纯的抗原，获得大量高度特异的、均一的抗体。适用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法,可用于体内的放射免疫显像和免疫导向治疗,单克隆抗体的优点与局限性,局限性：,固有的亲和性和局限的生物活性限制了它的,应用范围,反应强度不如多克隆抗体,制备技术复杂、费时费工、价格较高,McAb PcAb,抗原要求 可以不纯 纯度高,特异性 高 低,稳定 低 高,成本 高 低,McAb与PcAb,的比较,五、单克隆抗体的应用,1、作为医学检验试剂,2、作为亲合层析的配体,3、作为生物治疗的导向武器,三、基因工程抗体的制备,基因工程抗体（genetic engineering antibody）,在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的抗体。,如：人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）,改型抗体（reshaped humanized antibody）,小分子抗体：Fab片段,Fc片段,Fv片段,双特异性抗体（bispecific antibody），如：Ig-融合蛋白，抗体导向酶等。,嵌合抗体,第二节 抗原抗体反应及其应用,最早建立的免疫学检测技术是根据Ag，Ab特异性结合原理用已知Ag检测血清中未知Ab，故称为,血清学反应,。随着免疫学理论的进展及相关学科新技术在免疫学的应用，近年来建立了不少免疫学新技术。这些新技术不仅推动了免疫学的发展也是辅助疾病的诊断，疗效评估和探讨疾病机制的重要手段。,一、抗原抗体反应特点影响因素,（一）抗原抗体结合反应的特点:,1.高度特异性：,2.可逆性:,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种,动态平衡,其反应式为：Ag+AbAgAb,抗体的亲和力,：抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb,3.适当浓度和比例:,Ab过剩,4.敏感性:,在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml，免疫测定中凝胶扩散法的敏感度与酶反应法相仿。,（二）影响抗原抗体反应的因素:,1.电解质,：,抗原抗体特异结合后，胶体粒便可发生脱水作用，此时易受电解质影响，如有适当浓度的电解质存在就会使它们失去部分负电荷而相互凝聚，于是出现明显的凝集或沉淀现象。,2.酸碱度:,合适的pH为6-8。,3.温度:,37度通常是抗原体反应最适温度。,二、抗原抗体反应的应用,根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素，可将抗原抗体反应分为：,凝集反应,沉淀反应,补体参与的反应,中和反应,采用标记物的抗原抗体反应等,（一）,凝集反应（agglutination）,颗粒性抗原,（红细胞、细菌、乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。,1、,直接凝集,(direct agglutination),玻片凝集、试管凝集,2、,间接凝集,（indirect agglutination）,可溶性抗原或抗体包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗体或抗原混合出现的凝集现象。,正向间接凝集试验,反向间接凝集试验,反向间接凝集抑制试验,直接凝集反应,玻片法：ABO血型鉴定,颗粒性抗原,抗体（凝集素）,正向间接凝集反应,如：类风湿因子的检测,可溶性抗原,载体颗粒,抗体（凝集素）,反向间接凝集反应,抗体,可溶性抗原,载体颗粒,间接凝集抑制反应,如妊娠诊断试验检测HCG,凝集,凝集抑制,待检样品,待检样品,（二）沉淀反应（precipitation）,可溶性抗原,（如细菌浸出液，组织浸出液和动物血清等）与相应抗体结合后,在电解质存在条件下，经过一定时间作用后，可出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。在作定量试验时,常稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。,1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。,抗体混于琼脂凝胶中制板,沉淀环,环的直径与抗原含量成正相关,2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：,由于抗原抗体相关性不同，其产生的沉淀线可有三种基本类型：1)两种抗原的抗原决定簇完全相同，它们与相应抗体作用后形成一条融合沉淀弧线。2)两种抗原的抗原决定簇完全不同，形成各自独立，彼此交叉的两条沉淀线。3)两种抗原的抗原决定簇部分相同，形成一条融合带交叉的沉淀线。图示:,常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。,3.对流免疫电泳:,是一种将,双向扩散,和,电泳技术,相结合的检测方法。即在琼脂板上,使抗原和抗体在电场作用下定向移动,当抗原抗体相遇且二者浓度比例合适时,即可出现白色沉淀线。,4、免疫电泳（immunoelectrophoresis）,实验分二步,先用,电泳,将抗原各成分依电泳速度不同分开,再进行,双扩散,常用此法进行血清的蛋白种类分析,对于免疫球蛋减少或增多的疾病诊断或鉴别诊断有重要意义。,液相内沉淀反应,絮状沉淀反应,环状沉淀反应,如检测毛皮中是否含有炭疽杆菌,+,+,抗血清,抗原,抗原,抗体,凝胶内沉淀反应,免疫扩散技术,免疫电泳技术,单向扩散试验,双向扩散试验,火箭电泳,对流电泳,免疫电泳,（三）补体参与的反应:,1.溶血反应：,此法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测,比凝集反应敏感。,2.补体介导细胞毒试验:,细胞抗体补体引起细胞膜穿孔,此时加入染料后染料即可进入被穿孔的细胞,没有相应抗原的则不着色,此法常用于带各种抗原的细胞的检测、细胞表面抗原的鉴定,细胞及其亚群的计数及分离细胞。,3.补体结合试验:,待检系统,：已知抗原（或抗体）的待测抗体（或抗原）；,指示系统,：绵羊红细胞和溶血素；此外还有补体。,本反应常用来检测病人血清中的抗体，以诊断病毒性疾病和钩端螺旋体病等疾病，并可对分离的病毒和立克次体进行分型和鉴定。,补体结合试验(complement fixation test)：检测,抗原或抗体。原理：用已知的指示系统检测试验系,统是否结合补体进行诊断,检测系统：待测样品和已知抗原（或抗体）,指示系统：SRBC和溶血素,溶血阴性；不溶血阳性,补体,（四）中和试验:,中和抗体与病毒或抗毒素与外毒素结合后,引起病毒感染性或外毒素毒性丧失称中和试验。,1.病毒中和试验:,是病毒在活体内或细胞培养中被特异性抗体中和而失去感染性的一种试验，可用来检查患病后或人工免疫后机体血清中中和抗体的增长情况，也可用来鉴定病毒或研究病毒抗原结构。,2.毒素中和试验:,抗毒素与外毒素结合后使外毒素性消失的试验。临床可用抗毒素治疗由细菌外毒素所致的疾病。该试验也可用于抗毒效价的测定。,（五）免疫标记技术:,免疫标记技术是指用荧光素、酶、同位素等标记抗体或抗原所进行的抗原抗体反应;,三大标记技术:,同位素,标记技术;,免疫,荧光,技术;,酶,免疫测定。1.免疫荧光法:,原理:免疫荧光技术又称荧光抗体法。应用荧光素标记Ab测定未知Ag，通常在荧光显微镜下观察结果或用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)测定结果。荧光素:,异硫氰酸荧光素(FITC),呈黄绿色荧光;,巯基化藻红蛋白(PE),呈橙红色荧光。（1）直接荧光法:（2）间接荧光法:,（3）流式细胞术(flow cytometry):样品(细胞)经各种荧光素标记的不同抗体染色后可同时分析细胞表达的多种分子。,2.酶免疫测定法(enzyme immunoassay，EIA):,酶免疫技术是通过适当的酶促化学反应和免疫反应，使抗体（或抗原）与酶蛋白分子结合，形成酶标抗体（或抗原该结合物保留免疫学活性的酶活性,因而既有抗原抗体反应特异性,又有酶促反应的特异性。酶分解底物后的显色深浅可反映标本中抗原或抗体的含量。,常用酶：,辣根过氧物酶,、碱性磷酸酶。常用方法:酶联免疫吸附试验ELISA,1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay）,简称ELISA。,间接法:用于检测血清中抗体，原理是：图示:载体抗原 抗体（待检血清）酶标抗抗体底物-显色反应,双抗体夹心法:检测标本中抗原,原理是：图示:载体抗体 抗原（待检标本）酶标抗体（特异性）底物-显色反应,3.放射免疫测定法,（radioimmunoassay,RIA）:原理:放射性同位素(,131,I,或,125,I)标记Ag或Ab测定Ab或Ag,通过测定放射活性判断结果。该法常用于测定微量物质:如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及lgE等,4.免疫印迹法,（Western blot）该法又称Western印迹法:它将凝胶电泳与固相免疫结合，将通过电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再借助酶免疫、放射免疫等技术进行测定。,