第三章-酶150.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,核苷酸,（,1,）组成核苷酸的碱基,腺嘌呤,Adenine,（,1,）组成核酸的碱基,鸟嘌呤,guanine,1,核苷酸,（,1,）组成核苷酸的碱基,尿嘧啶,uracil,1,核苷酸,碱基的结构特征,碱基都具有芳香环的结构特征。嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面的结构。,碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式,-,烯醇式或胺式,-,亚胺式互变异构。,嘌呤碱和嘧啶碱分子中都含有共轭双键体系，在紫外区有吸收（,260 nm左右）,1,核苷酸,碱基的结构特征,1,核苷酸,胺,式,亚,胺,式,互,变,异,构,碱基的结构特征,1,核苷酸,胺,式,亚,胺,式,互,变,异,构,（,3,）核苷,nucleoside,糖与碱基之间的,C-N,键，称为,C-N,糖苷键,。,1,核苷酸,（,4,）核苷酸,nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。作为,DNA,或,RNA,结构单元的核苷酸分别是,5-,磷酸,-,脱氧核糖核苷和,5-,磷酸,-,核糖核苷。,1,核苷酸,(5),修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,1,核苷酸,ATP的性质,ATP,分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。,ATP,水解时,可以,释放出大量自由能,。,ATP,是生物体内最重要的,能量转换中间体,。,ATP,水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。,ATP,也是一种很好的,磷酰化剂,。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤。,3,多聚核苷酸,多聚核苷酸是通过核苷酸的,5,-,磷酸基与另一分子核苷酸的,C,3,-OH,形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。,由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为,DNA,链；,由核糖核苷酸聚合而成的则称为,RNA,链。,多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为,5-3,磷酸二酯键。,多聚核苷酸链一端的,C,5,带有一个自由磷酸基，称为,5-,磷酸端（常用,5,-P,表示）；另一端,C,3,带有自由的羟基，称为,3-,羟基端（常用,3,-OH,表示）。,多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是,53,或是,35,。,多聚核苷酸的特点,在多聚核苷酸（,DNA,或,RNA,）链中，由于构成核苷酸单元的戊糖和磷酸基是相同的，体现核核苷酸差别的实际上只是它所带的碱基，所以多聚核苷酸链结构也可表示为：,在讨论有关核酸问题时，一般只关心其中碱基的种类和顺序，,所以上式可以进一步简化为：,5,P,A,P,C,PG,P,T 3,或,5,ACGT 3,方向性,第三节 核酸的分子结构,多聚核苷酸是由四种不同的核苷酸单元按特定的顺序组合而成的线性结构聚合物，因此，它具有一定的核苷酸顺序，即,碱基顺序,。,核酸的碱基顺序是核酸的一级结构。,DNA,的碱基顺序本身就是遗传信息存储的分子形式。生物界物种的多样性即寓于,DNA,分子中四种核苷酸千变万化的不同排列组合之中。,mRNA(,信息,RNA),的碱基顺序，则直接为蛋白质的氨基酸编码，并决定蛋白质的氨基酸顺序。,（二）,DNA,的一级结构,DNA,的一级结构是指,DNA,的脱核糖核苷酸彼此连接的方式和排列顺序。,实验证明，组成,DNA,分子的几千个至几千万个脱氧核苷酸是以磷酸二酯键连接的，即由一,个脱氧核苷酸的脱氧核糖中的,5,位上的磷酸与另一个脱氧核苷酸的脱氧核糖中的,3,位上的羟基形成,3,，,5-,磷酸二酯键,。,DNA,没有分支链。书写多核苷酸链时，通常从,5,端到,3,端，由左向右表示,。,一.DNA的分子结构,（三）,DNA,的二级结构,1953,年，,J.Watson,和,F.Crick,在前人研究工作的基础上，根据,DNA,结晶的,X-,衍射图谱和分子模型，提出了著名的,DNA,双螺旋结构模型,，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,DNA,分子由两条,DNA,单链组成。,DNA,的双螺旋结构是分子中两条,DNA,单链之间基团相互识别和作用的结果。,双螺旋结构是,DNA,二级结构的最基本形式。,一.DNA的分子结构,（,2,）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成,90,角。,1.DNA,双螺旋结构的要点,DNA,双螺旋结构在生理条件下是很稳定的。,维持这种稳定性的因素包括：,（,1,）,氢键：,互补碱基对之间的氢键，但作用比较微弱，不是主要力量。,（,2,）,碱基堆积力：,由于芳香族碱基的,电子之间相互作用而引起的。现在普遍认为这种碱基堆积力是稳定,DNA,的主要力量。,（,3,）,离子键：,由磷酸残基上的负电荷与介质中阳离子之间形成的。这可减少双链间的静电斥力而稳定双螺旋结构。,2.DNA,双螺旋的稳定性,（四）,DNA,的三级结构,双链,DNA,分子常为线形，少数,DNA,分子的首尾以共价键连接成环状，在细胞内，这些双链环状,DNA,再做多次扭曲而形成麻花状的三级结构，也叫超卷曲,(supercoil),或超螺旋,(superhelix),结构，核小体中的,DNA,的扭曲方式即属于三级结构的构象,。,核酸的三级结构包括线状双链中的可能出现的纽结和超螺旋、多重螺旋和分子内单链形成的环以及环状,DNA,中的结、超螺旋和连环体等拓扑学状态。,拓扑学,:,研究几何图形在连续改变形状时仍然保留下来不变的一些结构特性。它只考虑物体之间的位置关系而不考虑它们的距离和大小。,一.DNA的分子结构,RNA,的一级结构是以,3,，,5-,磷酸二酯键连接而成的多聚核糖核苷酸链。,大多数天然,RNA,分子是一条单链，某些区域发生自身回折，回折部分的一些碱基互相靠近且互补配对形成链内氢键，构成双螺旋；不能配对碱基则形成环状突起。,RNA,有许多种，细胞内主要有三种主要类型,RNA,，即,tRNA,，,rRNA,，,mRNA,。,二,.RNA,的分子结构,（一）,RNA,的一级结构,2.mRNA一级结构的特点,1960年发现mRNA，占细胞RNA总量的3%5%。真核,细胞mRNA的3,-末端有一段长达200个核苷酸左右的,聚腺苷酸(polyA)，称为,“,尾结构,”,，5,-末端有一,个甲基化的鸟苷酸，称为,“,帽结构,”,。,动物细胞核糖体,rRNA,有四类：,5SrRNA,，,5.8SrRNA,，,18SrRNA,，,28SRNA,。许多,rRNA,的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明，但是对许多,rRNA,的功能迄今仍不十分清楚。,（一）,RNA,的一级结构,3.rRNA一级结构的特点,约占细胞RNA总量的75%80%。它与蛋白质结合构成核糖体(ribosome)。核糖核蛋白体是合成蛋白质的细胞器。它由大小两个亚基组成。,(1)氨基酸接受区,包含有tRNA的3,-末端和5,-末端，3,-末端的最后3个核苷酸残基都是CCA。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。,(2)反密码区,与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码子,(3)二氢尿嘧啶区,该区含有二氢尿嘧啶。,(4)T,C区,该区与二氢尿嘧啶区相对，假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核糖核苷环(,T,C)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(,T,C臂)与tRNA的其余部分相连。,(5)可变区,位于反密码区与,T,C区之间，不同的tRNA该区变化较大。,2.tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型tRNA的高级结构,一,.,核酸的一般性质,RNA,的纯品都呈白色粉末或结晶，,DNA,纯品则为白色类似石棉样的纤维状物。核酸和核苷酸大都呈酸性。,DNA,和,RNA,都微溶于水；不溶于乙醇、氯仿、戊醇、三氯醋酸等有机溶剂。,DNA,和,RNA,都是大分子。,DNA,的相对分子质,1.6106,2.2109,。因,DNA,的双螺旋结构又细长，,DNA,分子具有刚性及一定的柔性。大多数,DNA,分子为线形分子，分子极不对称，因此,DNA,溶液的粘度极高。,RNA,溶液的粘度要比,DNA,粘度小得多。,RNA,相对分子质量约为几万到几百或更大些。粘度可作为判断核酸变性或降解的指标之一。,在强大离心力作用时，生物大分子核酸下沉。测定核酸的沉降系数,S,就可计算出核酸的相对分子质量,二、两性解离、等电点,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。,由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如,DNA,的等电点为,4,4.5,，,RNA,的等电点为,2,2.5,。,RNA,的等电点比,DNA,低的原因，是,RNA,分子中核糖基,2-OH,通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，,DNA,没有这种作用。,三,.,核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,四,.,核酸的变性、复性与杂交,1.,核酸的变性,核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构,(,碱基顺序,),保持不变。,能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,四,.,核酸的变性、复性与杂交,D,N,A,变,性,四,.,核酸的变性、复性与杂交,D,N,A,变,性,当,DNA,的稀盐溶液加热到,80-100,时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。,DNA,变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如生物活性丧失、粘度下降、浮力密度增大、沉降系数增加、紫外吸收,(260 nm),值升高,粘度降低等。,四,.,核酸的变性、复性与杂交,增色效应,RNA,本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起的性质变化没有,DNA,那样明显。,利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。,核酸变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积已不存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，这样就使得变性后的,DNA,对,260nm,紫外光的吸光率比变性前明显升高（例如，天然状态的,DNA,在完全变性后，紫外吸收值增加,25,40%,；而,RNA,变性后，约增加,1.1%,），这种现象称为,增色效应,.,四,.,核酸的变性、复性与杂交,熔点或解链温度,Tm,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起DNA变性的温度称为,“,熔点,”,或解链温度，用,T,m,表示。,一般DNA的,T,m,值在70-85,C之间。DNA的T,m,值与分子中的G和C的含量有关。,G和C的含量高，,T,m,值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G,C含量，可通过经验公式计算：,（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,四,.,核酸的变性、复性与杂交,2.,核酸的复性,核酸热变性后，双螺旋结构中的两条,DNA,单链分开为单链，如果把此热溶液迅速冷却，则两条单链继续保持分开；若将此热溶液缓慢冷却,(,称退火处理,),，则两条单链可发生特异的重组合而恢复双螺旋。这一过程叫复性,(,冷却重组,),四,.,核酸的变性、复性与杂交,3.,核酸的杂交,热变性的,DNA,单链，在复性时并不一定与同源,DNA,互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源,DNA,单链形成双螺旋结构。,这样形成的新分子称为杂交,DNA,分子。,DNA,单链与互补的,RNA,链之间也可以发生杂交。,核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,核酸的杂交,五,.,核酸的水解及酶解,1.,酸或碱水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。,DNA,和,RNA,对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在,0.1 mol/L NaOH,溶液中，,RNA,几乎可以完全水解，生成,2-,或,3-,磷酸核苷；,DNA,在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与,RNA,核糖基上,2-OH,的邻基参与作用有很大的关系。在,RNA,水解时，,2-OH,首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。,五,.,核酸的水解及酶解,2.,酶水解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。,以,DNA,为底物的称,DNA,水解酶（,DNases,）和以,RNA,为底物的称,RNA,水解酶（,RNases,）。,根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。,核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（,3-,端或,5-,端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。,在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,六,.,核酸的分离提纯,1.,分离原则,2.DNA,的提取,3.RNA,的提取,P112-113,二、RNA与生物遗传信息的表达,首先，DNA通过转录作用，将其所携带的遗传信息（基因）传递给mRNA,在三种 RNA（mRNA、tRNA和rRNA）的共同作用下，完成蛋白质的合成。,第五节 核酸的生物功能,中心法则,生物的遗传信息从 DNA传递,给mRNA的过程称为,转录,。然,后根据mRNA链上的遗传信息,合成蛋白质，这个过程称为,翻译和表达,。1958年Crick,将生物遗传信息的这种传递,方式称为,中心法则,。,1.,基因的转录,mRNA,的合成,基因转录是以,DNA,为模板合成与其碱基顺序互补的,mRNA,的过程。,细胞生长周期的某个阶段，,DNA,双螺旋解开成为转录模板，在,RNA,聚合酶催化下，合成,mRNA,。,mRNA,不能自我复制,，即其本身不能作为复制模板，因此在转录过程中即使出现某些差错，也不会遗传下去。,mRNA,是,DNA,的转录本，携带有合成蛋白质的全部信息。,蛋白质的生物合成实际上是以,mRNA,作为模板进行的,。,2.,遗传密码,mRNA,分子中所存储的蛋白质合成信息，是由组成它的四种碱基（,A,、,G,、,C,和,U,）以特定顺序排列成三个一组的三联体代表的，即每三个碱基代表一个氨基酸信息。,这种代表遗传信息的三联体称为,密码子或三联体密码子,。,因此,mRNA,分子的碱基顺序即表示了所合成蛋白质的氨基酸顺序。,mRNA,的每一个密码子代表一个氨基酸。,20,种基本氨基酸的三联体密码子都已经确定。此外，还有一个密码子是肽链合成起始密码子,三个是终止密码子，以保证蛋白质合成能够有序地进行。,遗传密码,1.DNA,结构变化的类型及影响因素,生物遗传变异的分子机制是,DNA,分子中为氨基酸编码的三联体密码子的改变。,DNA,遗传密码的改变主要有如下几种类型：,碱基顺序颠倒，如,TA,被颠倒成,AT,；,某个碱基被调换，如,AT,换成,GC,；,(1)DNA,分子中碱基互变异构,DNA,分子的碱基，存在酮式,-,烯醇式或氨式,-,亚胺式互变异构。不同的互变异构体形成氢键的方向和能力不同，有可能导致复制时出现错误。,例如在正常情况下，,A,（氨式结构）与,T,（酮式结构）配对；当,A,以亚胺式存在时（几率非常小），则与,C,配对。,能够引起基因突变的物理因素主要包括：紫外线（UV,）、高能射线和电离辐射等。,(2),物理因素引起突变,当,DNA,受到大剂量紫外线（波长,260nm,附近）照射时，可引起,DNA,链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如,TT,二聚体。,光聚合反应,胸腺嘧啶碱基在紫外光照射下，可以发生二聚加成反应：,在,DNA,分子中，如果两个胸腺嘧啶碱基相邻，在紫外光照射下，可能发生上述聚合反应，其结果是破坏了正常复制或转录。,(3),化学因素引起突变,化学因素是引起,DNA,结构发生变化的最常见因素，主要包括：烷基化试剂，亚硝酸盐以及碱基类似物等。,烷基化试剂能够与,DNA,分子中的氨基或氧作用，生成烷基化,DNA,。除了碱基上有多个位置可被烷基化外，,DNA,链上磷酸二酯键中的氧也容易被烷基化，从而导致,DNA,链的断裂。,