第一讲噬菌体展示技术1.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,第一讲 噬菌体展示技术,郭爱珍,Tel:[phone],E-mail:,aizhen,mail.,hzau,.,edu,.,cn,预防兽医学进展,第一讲 噬菌体展示技术,噬菌体的有关特征,噬菌体展示的原理,噬菌体展示的应用举例,噬菌体（,bacteriophage,phage）,噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒，在葡萄球菌和志贺菌中首先发现。,病毒的特性：,个体微小，可以通过细菌滤器,没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成,专性细胞内寄生的微生物,分布极广,噬菌体的生物学性状,形态,个体小，需用电子显微镜观察,蝌蚪形、微球形和丝形,LG1 was isolated from chicken feces on an,E,.,coli,O157:H7 host,but it plaques on a wide range of,E,.,coli,and a few Enterobacteriaceae.The black bars are size bars representing 100 nm.,噬菌体的生物学性状,phage T2 micrograph,This is a viral diversity tableau using images from a saline lake bacteriophage study done with Richard Robarts of Environment Canada in Saskatoon.Note the rather large diversity found in these environments.Because there were no eukaryotic competitors,the phage-to-bacterium ratios in these lakes is often very high-up to 100.,噬菌体的生物学性状,结构,大多数噬菌体呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成,大肠埃希菌,T4,噬菌体，头部和尾部,噬菌体,化学组成,蛋白质,构成噬菌体的头部的衣壳及尾部，包括尾髓、尾鞘、尾板、尾刺和尾丝，起着保护核酸的作用，并决定噬菌体外形和表面特征。,核酸-遗传物质,基因组大小2200,Kb,核酸为,DNA,或,RNA，,大多数噬菌体的,DNA,为双链,DNA，,但一些微小,DNA,噬菌体的,DNA,为环状单链。多数,RNA,噬菌体的,RNA,为线状单链，少数为线状双链，且分成几个节段。,某些噬菌体的基因组含有异常碱基如大肠埃希菌,T2,噬菌体无胞嘧啶，而代以5-羟甲基胞嘧啶与糖基化的5-羟甲基胞嘧啶；某些枯草芽胞杆菌噬菌体无胸腺嘧啶，而代以尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶。因宿主细胞内没有这些碱基，可成为噬菌体,DNA,的天然标记。,噬菌体的生物学性状,噬菌体,宿主菌,形态,核酸,T1-T7、N4,大肠埃希菌,蝌蚪形,dsDNA，,线状,P1,志贺菌,蝌蚪形,dsDNA，,线状,P22,沙门菌,蝌蚪形,dsDNA，,线状,SP01、SP82,枯草芽胞杆菌,蝌蚪形,dsDNA，,线状,29,解淀粉芽胞杆菌,蝌蚪形,dsDNA，,线状,PM2,假单胞菌,微球形，有包膜,dsDNA，,线状,X174、S13、M12、G4,大肠埃希菌,微球形,ssDNA，,线状,f1、fd、M13,大肠埃希菌,丝形,ssDNA，,线状,MS2、f2、fr、Q,大肠埃希菌,微球形,ssRNA，,线状,6,假单胞菌,微球形，有包膜,dsRNA，,线状，分成3节段,噬菌体的生物学性状,抗原性,噬菌体具有抗原性，能刺激机体产生抗体。该抗体能抑制相应噬菌体侵袭敏感细菌，但对已吸附或已进入宿主菌的噬菌体不起作用，噬菌体仍能复制增殖。,噬菌体的生物学性状,抵抗力,比一般细菌的繁殖体强,抵抗乙醚、氯仿和乙醇,75 30,min,或更久才能被灭活,耐受低温和冰冻,但对紫外和,X,射线敏感，一般经紫外照射 1015,min,即失去活性。,毒性噬菌体,毒性噬菌体(,virulent phage),能在宿主菌细胞内复制增殖,产生许多子代噬菌体，并最终裂解细菌，称为毒性噬菌体。,温和噬菌体(,temperate phage),噬菌体基因与宿主菌染色体整合，不产生子代噬菌体，但噬菌体,DNA,能随细菌,DNA,复制，并随细菌的分裂而传代，称为温和噬菌体或溶原性噬菌体(,lysogenic phage)。,毒性噬菌体,增殖过程,吸附,穿入,生物合成,成熟与释放,毒性噬菌体,吸附,是噬菌体与细菌表面受体特异性结合的过程，特异性取决于噬菌体蛋白与宿主菌表面受体分子结构的互补性。,吸附方式,丝形噬菌体以其末端吸附，有尾噬菌体以尾丝、尾刺吸附。,丝形噬菌体如,M13，f1,等及微球形噬菌体如,MS2,等是吸附在性菌毛上，所以只感染有性菌毛的,F,+,菌。,只要细菌有特异性受体，不论死活噬菌体都能吸附，但噬菌体不能进入死亡的宿主菌。,毒性噬菌体,穿入,有尾噬菌体吸附宿主后，借助尾部末端含有的一种类似溶菌酶的物质，在细菌细胞壁上溶一小孔，然后通过尾鞘的收缩，将头部,DNA,注入细菌体内，而蛋白衣壳留在菌细胞外。,无尾噬菌体与丝形噬菌体可以脱壳的方式进入细菌细胞内。,毒性噬菌体,生物合成,转录形成,mRNA，,转移成噬菌体所需的酶、调节蛋白和结构蛋白。,以噬菌体核酸为模板，通过核酸多聚酶催化作用，大量复制子代噬菌体的基因核酸。,成熟与释放,蛋白质和核酸合成后，在细胞质内按一定程序装配成成熟的噬菌体。,当子代达一定数目后，菌细胞突然裂解，释放出的噬菌体又能感染新的敏感细菌。但有些丝形噬菌体以出芽方式逐个释放。,毒性噬菌体,毒性噬菌体,在液体培养基中，噬菌现象可使浑浊菌液变为澄清.,在固体培养基中，若用适量噬菌体和宿主菌液混合后接种培养，培养基表面可有透亮的溶菌空斑出现。一个空斑系由一个噬菌体复制增殖并裂解细菌后形成的，称为噬斑（,plaque）。,若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬斑计数，可测知一定体积内的噬斑形成单位数目，即噬菌体的数量。,噬 斑,温和噬菌体,前噬菌体,整合在细菌基因组中的噬菌体基因组称为前噬菌体（,prophage溶原性细菌,带有前噬菌体基因组的细菌称为溶原性细菌（,lysogenic bacterium）,温和噬菌体,溶原性,前噬菌体偶尔可自发或在某些理化和生物因素的诱导下脱离宿主菌基因组而进入溶菌周期，产生成熟噬菌体，导致细菌裂解。温和噬菌体的这种产生成熟噬菌体颗粒和溶解宿主菌的潜在能力称为溶原性（,lysogeny）。,温和噬菌体可有三种存在状态,游离的具有感染性的噬菌体颗粒,宿主菌胞质内类似质粒形式的噬菌体核酸,前噬菌体,温和噬菌体,溶原状态,十分稳定，能经历许多代,在某些条件如紫外线、,X,线、致癌剂、突变剂等作用下，可中断溶原状态进入溶菌性状态，这称为前噬菌体的诱导与切离，发生率为10,2,10,-5,。,极少数溶原性细菌中的前噬菌体离开细菌基因组后，不进入溶菌性周期，这个现象被形象地称之为“治愈”。,温和噬菌体,溶原性转换（,lysogenic conversion）,某些前噬菌体可导致细菌基因型和性状发生改变，这称为溶原性转换。,白喉棒状杆菌产生白喉毒素，是因其前噬菌体（,-,棒状噬菌体）带有毒素蛋白结构基因（,tox,基因）。,A,群溶血性链球菌受有关温和噬菌体感染发生溶原性转换，能产生致热外毒素。,肉毒梭菌的毒素、金黄色葡萄球菌溶素的产生，以及沙门菌、志贺菌等的抗原结构和血清型别都与溶原性转换有关。,温和噬菌体,噬菌体的应用,细菌的鉴定,噬菌体与宿主菌的关系有高度特异性，可用于未知细菌的鉴定和分型。如应用伤寒沙门菌,Vi,噬菌体可将有,Vi,抗原的伤寒沙门菌分成96个噬菌体型。,噬菌体的应用,分子生物学研究的重要工具,噬菌体基因数量少，结构比细菌和高等细胞简单得多，而且容易获得大量的突变体。,噬菌体可用来构建基因文库,基因工程载体,噬菌体展示技术,噬菌体的应用,细菌感染的诊断与治疗,应用噬菌体效价增长试验可检测标本中的相应细菌。在怀疑有某种细菌存在的标本中，加入一定数量的已知噬菌体，37孵育68,h，,再测定该噬菌体的效价。,辅助治疗，如应用铜绿假单胞菌噬菌体治疗创口感染。,噬菌体展示技术,原理,操作,应用,原 理,80年代中期，,George Smith,在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术,将外源蛋白分子或多肽的基因克隆到丝状噬菌体基因组中，与噬菌体外膜蛋白融合表达，展示在噬菌体颗粒的表面（即外源,DNA,片段插入基因,III,或,VIII,中位于切割部位下游的几个核苷酸处）,外源肽可以被抗体、酶、和其他专一配体识别,噬菌体的形态发生和转染功能不受外源肽的影响,应 用,噬菌体肽库技术应用范围很广,可用于表位的确定,描述蛋白之间的作用,确定非蛋白配体的蛋白模拟表位,受体的活性作用分子筛选,酶底物的确立,分析,DNA,结合蛋白等,随着生物技术的发展，其应用领域也越来越广,噬菌体随机肽展示技术流程图,IBV,第三轮淘筛阳性噬菌体的,ELISA,鉴定,ctrl,ctrl,2,3,4,7,11,12,14,16,噬菌体稀释倍数,0.07,-0.02,0.66,0.60,0.52,0.47,0.55,0.65,0.63,0.53,1:2,0.06,0.01,0.58,0.53,0.44,0.39,0.36,0.36,0.43,0.37,1:4,0.07,0.02,0.47,0.44,0.35,0.35,0.13,0.27,0.29,0.20,1:8,0.03,0.02,0.13,0.10,0.11,0.09,0.16,0.13,0.12,0.11,1:16,第,3,轮淘筛阳性噬菌体,2,稀释时,OD630,的比较,ELISA,程序：包被噬菌体，依次叠加病毒，兔抗,IBV,抗血清和羊抗兔二抗，再加底物进行显色，测定,630nm,吸光值。,Peng Bo et al.,2005,第,4,轮淘筛阳性噬菌体的鉴定,ctrl,ctrl,1#,2#,6#,7#,10#,11#,12#,13#,14#,噬菌体稀释倍数,0.02,0.09,0.53,0.55,0.58,0.59,0.56,0.71,0.87,0.82,0.78,1:2,0.02,0.01,0.44,0.50,0.52,0.50,0.53,0.64,0.74,0.68,0.68,1:4,0.00,0.02,0.37,0.37,0.39,0.35,0.46,0.57,0.58,0.53,0.59,1:8,0.01,0.06,0.34,0.30,0.27,0.29,0.36,0.47,0.40,0.42,0.41,1:16,第,4,轮淘筛阳性噬菌体,2,稀释时,OD630,的比较,阳性噬菌体氨基酸序列比较,编号,氨基酸序列,16,G,S,H,H,R,H,V,H,S,P,F,V,3,H,H,D,H,R,P,P,P,L,Q,R,P,12,H,H,T,H,Q,A,S,F,M,T,R,L,2,H,H,E,H,Y,K,A,V,Y,T,T,H,11,S,P,PNTLNH,H,H,S,H,14,Y,S,K,P,L,H,H,V,H,M,Q,P,第三轮淘筛所得阳性噬菌体所含多肽的氨基酸序列,阳性噬菌体氨基酸序列比较,编号,氨基酸序列,8#,G,S,H,H,R,H,V,H,S,P,F,V,14#,G,S,H,H,R,H,V,H,S,P,F,V,13#,G,S,H,H,R,H,V,H,S,P,F,V,12#,H,H,PS,H,F S F S,S,P,A,10#,H,H,T,H,W P L,S,A,R,T,G,7#,H,H,T,H,Q,A,S,F,M,T,R,L,1#,H,H,E,H,YKA,V,Y,T,T,H,11#,H,H,Y,D,TYW,V,WTT,S,2#,WA,WP,T,H,T,H,S,P,P,P,6#,YKFE,YSEG,H,N,L,H,第四轮淘筛所得阳性噬菌体所含多肽的氨基酸序列,阳性噬菌体的鉴定,血凝抑制试验,非特异性检测试验,抗原抗体阻断实验,病毒感染阻断实验,人工合成多肽，重复以上试验,血凝抑制试验结果,IBV+RBC,Phage+RBC,6 1 2 7 10 11 12 14,Phage+IBV+RBC,unrelated phage+IBV+RBC,RBC,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,噬菌体稀释倍数,噬菌体,2,倍开始倍比稀释，与病毒等体积混合，然后置于,37,反应,1h,，然后加入浓度为,0.5%,的新鲜鸡红细胞。,AIV+Phage+RBC,NDV+Phage+RBC,IBV+Phage+RBC,IBV+RBC,AIV+RBC,NDV+RBC,Unrelated phage+IBV+RBC,Phage+RBC,RBC,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,噬菌体稀释倍数,非特异性检测试验结果,用具有血凝特性的新城疫病毒（,NDV,）和禽流感病毒（,AIV,）及非特异性噬菌体做对照，以,14#,噬菌体为例验证阳性噬菌体对其他病毒是否具有血凝抑制作用。,抗原抗体阻断实验,噬菌体稀释倍数,噬菌体数,(PFU),对照,病毒对照,噬菌体阻断,10,2.5,10,31,0.000,0.723,0.805,20,1.25,10,31,-0.006,0.711,0.767,80,6.25,10,30,-0.008,0.731,0.675,160,3.125,10,30,0.006,0.662,0.681,320,1.563,10,30,0.108,0.737,0.682,640,7.812,10,29,0.033,0.671,0.638,1280,3.906,10,29,0.031,0.646,0.626,2560,1.953,10,29,0.062,0.721,0.636,平均值,SD,0.03,0.03,0.69,0.07,0.70,0.03,包被病毒,加噬菌体,加一抗,加二抗,加底物,测,OD,值,病毒感染阻断实验,Phage No,1,2,6,7,10,11,12,14,Peptide 1#,Peptide 2#,对照,NT titers,136,134,104,120,120,160,90,178,240,0,0,第四轮淘筛后噬菌体及多肽的中和效价,噬菌体,(,起始浓度,2.5,1031 PFU),多肽,(,起始浓度,8.3,g/ml),200,个,TCID,50,病毒,+,37,1h,加入,HeLa,细胞,37,培养,用,Reed-Muench,方法计算中和效价,A,B,C,A,：病毒对照；,B,：细胞对照；,C,：噬菌体对照。,D,：噬菌体,10,倍稀释时对细胞感染的阻断。,E,：噬菌体,320,倍稀释时对细胞感染的阻断。,F,：噬菌体,1280,倍稀释时对细胞感染的阻断。,D,E,F,A,B,C,细胞感染抑制试验,人工合成多肽的特性鉴定,Peptide 1（N GSH HRH VHS PFV C）,来自于14号噬菌体,该多肽也能够阻断,IBV,对,HeLa,的感染,细胞感染抑制滴度为1:240,相应浓度为8.3,g/ml,或6.0,M,该合成多肽不能抑制,IBV,的血凝作用,Peptide 2（N NYT SHQ GHM VAL C）,受体猫氨基肽酶,N（feline aminopeptidase N，fAPN）(GenBank accession no.U58920),无细胞感染抑制作用与血凝抑制作用,“,HXXH”,结构域的作用有待进一步鉴定,噬菌体抗体库,采用,RTPCR,技术将全套人抗体重链,V,区基因克隆出来，在噬菌体表面以抗体外壳融合蛋白的形式表达分泌，经筛选后获得特异性抗体。,该技术不经过繁杂的杂交瘤途径，即可获得全人源化抗体。从理论上讲该抗体库可筛选出任何一种单抗。,噬菌体抗体库,与传统杂交瘤技术相比有极大的优越性，现正取代杂交瘤技术。主要特点：,简单易行，采用经典的,PCR,分子克隆等技术，即可操作；,在短期内（数周）可筛选,10,6,10,8,个克隆；,筛选获得的抗体库抗体可用原核表达系统表达，无需组织培养，极大降低了成本；,制备的抗体通常为,Fab,片段或,ScFv,抗体，没有,Fc,段，亲和力有一定影响（某些肿瘤治疗性单抗亲和力太强反而不好），但如果对某些抗体基因进行改构，同样可获得亲和力强的抗体。,噬菌体抗体展示原理,用抗体展示文库筛选抗原,NEB,产品,NEB,提供了3种随机肽库和供自制肽库所需的,M13KE,克隆展示载体。这3种肽库包括7肽库（,Ph.D.-7），12,肽库（,Ph.D.-12）,和抑制二硫键的7环肽库（,Ph.D.-C7C）。,Ph.D.-C7C,随机肽库所展示的多肽两侧各加了一个半胱氨酸。噬菌体组装时经过氧化，形成环化的多肽。,上述肽库表达的随机肽均在噬菌体次要包膜蛋白,p,的,N,端，故每一个病毒粒子可以表达5个拷贝。,Ph.D.-7,和,Ph.D.-12,肽库表达的展示肽就是展示肽本身，不含有其它额外氨基酸，但是,Ph.D.-C7C,表达的展示肽前含有丙氨酸和半胱氨酸。,所有的肽库在展示肽和,p,之间的连接肽，是由甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸组成。,公司产品,New England Biolabs:,Novagen:,Invitrogen:,Amersham-Pharmacia Biotech:,噬菌体展示研究进展,已成为后基因组时代研究蛋白质相互作用的强有力工具,以往展示以,M13,为载体，适合于小分子展示,最近,Novagen,公司开发为,T7,噬菌体载体，插入片段可为300,bp-3000bp,或50-1200,aa,同时可保持一定构象,应用：蛋白质与蛋白质（信号传导、受体配体、多肽药物筛选），抗原与抗体、,DNA,与蛋白质的相互作用,