第七章-蛋白质的共价修饰.ppt

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text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth 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style,*,第七章,蛋白质的共价修饰,7.1,蛋白质的共价修饰,新生多肽链离开核糖体很少是有功能的，多数都必须经过翻译后修饰才会转变为成熟的蛋白质。例如原核细胞和真核细胞的蛋白质合成分别以甲酰蛋氨酸（,fMet,）和蛋氨酸（,Met,）起始，而成熟蛋白质,N-,端没有,fMet,，很少为,Met,，因为在肽链合成尚未完成时,N-,端已被去甲酰基酶和氨肽酶修饰过。分泌蛋白和膜蛋白以及线粒体和叶绿体蛋白均以前体形式合成，,N-,端的信号序列在分拣运输中已被切除。许多蛋白质要分别经过甲基化、羟基化、糖基化、羧基化、磷酸化、乙酰化、脂酰化和异戊烯基化等共价修饰。其中蛋白质可逆磷酸化作用，本章将重点介绍。,7.1.1,蛋白质前体的加工性部分水解,动物细胞内存在多种加工性蛋白酶，如弗林蛋白酶（,furin,）和前激素转换酶,PC1,、,PC2,、,PC3,，能识别前体分子中的双碱性序列,-RR-,、,-KR,、,-KK-,等，从其羧基一侧切断肽链。,furin,负责细胞中组成型表达的蛋白前体加工，,PC1,PC3,负责受调控的激素前体的切割加工。胰岛素在,细胞中以前胰岛素原的形式合成，进入,ER-Golgi,系统中先切,N-,端的信号肽，重排二硫键，形成正确折叠的胰岛素原。在分泌小泡中由,PC2,和,PC3,切去中间的,C,肽，产生的,A,链与,B,链由两个二硫键相连，再切去,B,链,C-,端两个精氨酸，成为成熟的胰岛素。,Insulin Maturation,脑垂体细胞合成的前阿片促黑皮质素（,POMC,）由,265,个氨基酸组成，在垂体前叶中被加工成,-,促脂解素（,-LPH,）和促肾上腺皮质激素（,ACTH,）；在垂体中间叶则被加工成,-,促黑素（,-MSH,）、,-LPH,、,内啡肽和中间叶促皮质样肽（,CLIP,）。通过组织专一的加工，一个基因编码的前体在不同组织中按严格的比例产生多种不同的生理活性产物，具有重要的生理意义。,多蛋白前体的水解裂解,（,5,）脯氨酰和赖氨酰的羟基化,：,胶原是脊椎动物体内最丰富的蛋白质。胶原新生肽链在内质网腔内首先在脯氨酰,-4-,羟化酶（识别,-Gly-x-Pro-,）和赖氨酰羟化酶（识别,-Gly-x-Lys-,）催化下，生成,4-,羟脯氨酰和,-,羟赖氨酰，再由脯氨酰,-3-,羟化酶（识别,-Gly-Pro-Hyp-,）把中间的脯氨酰,3-,羟基化，然后,Hyl,再糖基化，才能形成三股螺旋前胶原。分泌到胞外后，切去,N-,端和,C-,端肽段，变为成熟的原胶原。原胶原自发聚合形成胶原微纤维。羟赖氨酰氧化酶催化,Hyl,形成醛赖氨酰，两个醛赖氨酰缩合成醇醛，进一步与,His,和,Hyl,残基反应形成链间共价交联，成为稳定和强度高的胶原蛋白。,（,6,）,ADP-,核糖基化,：蛋白质的,ADP-,核糖基化普遍存在于各类生物。哺乳动物核外蛋白质以单,ADP-,核糖基化为主，,ADP-,核糖基转移酶从,NAD,+,中把,ADP-,核糖基转移到,Arg,、,Asn,或,His,的修饰产物白喉酰胺的侧链,N,原子上。核内蛋白大多发生多聚,ADP-,核糖基化，,ADP-,核糖基聚合酶（,PARP,）先将,NAD,+,中的,ADP-,核糖基转移到,Glu,侧链羧基上，再不断添加,ADP-,核糖基，形成含有数百个,ADP-,核糖且有分枝的多聚,ADP-,核糖。,PARP,自己就以这种方式修饰，并参与,DNA,断裂的修复。白喉毒素、百日咳毒素和霍乱毒素等具有,ADP-,核糖基转移酶活性，分别把,ADP-,核糖基转移到白喉酰胺、,Cys,和,Arg,残基上。,ADP-ribosylation,is a general mechanism by which activity of many proteins is regulated,7.1.3,蛋白质与脂类共价结合,1.,蛋白质与糖基肌醇磷脂（,glycosylphosphatidylinositol,GPI,）共价结合,：,某些蛋白质新生肽链的停止转运肽位于,C-,端，被内质网转肽酶切除后，生成新的,C-,端在膜中与,GPI,乙醇胺的氨基反应，以酰胺键与,GPI,连接定位于内质网膜内侧，然后运到质膜成为膜锚蛋白。哺乳动物至少有,50,多种蛋白以此种方式与膜结合，包括水解酶、受体、粘附分子、补体抑制因子和功能不详的表面抗原等。,GPI,是由膜中组分,PI,糖基化再与磷酸乙醇胺结合而成的，合成途径酶缺陷将导致细胞表面,GPI,结合蛋白缺乏。人类阵发性睡眠性血红蛋白尿症就是由于基因突变导致,GPI,合成的第一步受阻，使得红细胞表面缺乏补体衰变加速因子、,CD59,等,GPI,结合蛋白，造成补体异常活化而使红细胞溶解。,2.,豆蔻酰化：,在,N-,端豆蔻酰转移酶催化下，有些蛋白质,H,2,N-Gly-x-x-x-Ser/Thr-Lys,（,Arg,）,-Lys,（,Arg,）,-,的,N-,端氨基酸以酰胺键与一个豆蔻酰基相连，并以此插入脂双层成为一种膜锚蛋白。,G,蛋白,亚基、,Src,或介导小泡运输的,Arf,均以这种方式与质膜或小泡膜结合。这种修饰是伴翻译的，不可逆。,3.,棕榈酰化,：棕榈酰基转移酶可将棕榈酰基转移至一些肽链,C-端附近的,Cys,残基上，使之成为膜锚蛋白；经硫酯酶水解切去棕榈酰基重新成为可溶性胞质蛋白。这种细胞定位的改变与其功能调节有密切关系。,4.C-,端异戊烯基化,：一些,C-,端为,-C-xx-S/M/Q-COOH,的肽链，在酶催化下从法尼基焦磷酸上把含,3,个异戊二烯单位的法尼基转移到,Cys,残基,S,原子上，再由水解酶切掉,Cys,后面的残基，产生的新羧基端又被甲基化，通过法尼基把蛋白质锚定在膜上。,Ras,蛋白即以这种方式与膜结合，如阻断其法尼基化反应，也就阻断了它与膜的结合，从而逆转,Ras,转化细胞的功能。,C-,端为,-CC,、,-CxxL,或,-CxC,的肽链不进行法尼基化而发生牻牛儿牻牛儿基化，在,Cys,的,S,原子上连接由,4,个异戊二烯单位聚合而成的牻牛儿牻牛儿基。疏水尾巴越长，膜锚蛋白与膜的结合越牢固。,7.1.4,泛素化及泛素样修饰,1.,蛋白质泛肽化,泛肽,-26S,蛋白酶体系统除负责细胞溶胶和细胞核内短寿命蛋白和反常蛋白的降解以及,类,MHC,抗原肽的加工外，显然还参与了膜受体、转运体的下调。组蛋白的泛肽化与转录调控有关,The Ubiquitin Proteosome Pathway,Ubiquitin(Ub)is a small protein that is composed of 76 amino acids,Ub is attached(conjugated)to proteins through a covalent bond between the glycine at the C-terminal end of Ub and the side chains of lysine on the proteins,S,mall,U,biquitin-like,Mo,difier or,SUMO,proteins are a family of small proteins that are covalently attached to and detached from other proteins in cells to modify their function,SUMO modification of proteins has many functions.Among the most frequent and best studied are protein stability,nuclear-cytosolic transport,and transcriptional regulation.,Pathway is similar to ubiquitin,2.Protein SUMOylation,Structure comparison of ubiquitin and human SUMO-1.Both proteins share a characteristic tightly packed fold,and a C-terminal diglycine motif.SUMO is distinguished by a long and flexible N-terminal extension.The structure of ubiquitin was determined by X-ray crystallography;the structure of SUMO in solution by NMR,SUMO conjugation/deconjugation cycle.SUMO/Smt3 is synthesized as a precursor with a short C-terminal extension,which in S.cerevisiae is cleaved off by the processing protease Ulp1.For conjugation,the C-terminus of mature SUMO needs first to be activated by the SUMOactivating,enzyme(E1),a heterodimeric protein composed of Uba2 and,Aos1.Activation is ATP-dependent,proceeds via a SUMO-adenylate intermediate,and results in SUMO being linked by a thioester to a cysteine residue in Uba2.Activated SUMO is then transferred,in a transesterification reaction,to a cysteine residue of Ubc9,a conjugating enzyme(E2)specific for SUMO.In conjunction with the substrate recognizing SUMO,ligases(E3),Ubc9 conjugates SUMO to a variety of substrate proteins.Sumoylated substrates are deconjugated by two isopeptidase activities residing in the Ulp1 and Ulp2 proteases.,SUMO targets,Model Explaining How SUMO Modification Acts to Transfer a Transcription Factor from the Active to the Repressed State.A nuclear transcription factor(NF-X)is modified by SUMO(1)and is assembled(2)into a repression complex by the action of a SUMO specific assembly factor(not shown).Once the repression complex has been formed the assembly factor dissociates and the SUMO can be deconjugated(3)by the action of a SUMO specific protease.The transcription factor is retained in the repression complex in a SUMO independent fashion(4).Dissociation of the complex(5)may occur slowly during the life of the cell or it can be induced by post-translational modification of components of the complex or by modification of NF-X.The transcription factor can be modified by a different ubiquitin-like protein or another modification that facilitates disruption of the complex and release of the active transcription factor.This may involve the action of an additional disassembly factor(not shown).,Alternative Model To Explain Transcriptional Repression by SUMO.A nuclear transcription factor(NF-X)is modified by SUMO(1)and is bound to transcriptionally active chromatin(green).The chromatin bound,SUMO-modified transcription factor recruits a chromatin modifying enzyme(CME)that leaves a posttranslational mark(M)on the chromatin.In turn this leads to transcriptional silencing(red).The CME dissociates(3)and SUMO is deconjugated from the transcription factor by SUMO specific proteases(4).The modified chromatin remains transcriptionally silent.,7.1.5 Histone Covalent Modification,1.Acetylation and Deacetylation,2.Methylation and Demethylation,3.Ubiquitination and Deubiquitination,4.Phosphorylation and Dephosphorylation,Chromatin:An Overview,Histone Modifications Alter Chromatin Structure and Gene Activation,Histone modifications on the nucleosome core particle.The nucleosome core particle,showing six of the eight core histone N-terminal tail domains and two C-terminal tails.The core particle consists of two copies each of histones H2A,H2B,H3 and H4,around which are wrapped 146 base pairs of DNA.The structure shown is based on the original,low-resolution X-ray structure.The histone tails are not amenable to X-ray analysis and are probably unstructured;they are shown fully extended.Sites of post-translational modification are indicated by defined colored symbols(lower left).Residue numbers are shown for each modification.H3 Lys9 can be either acetylated or methylated.The C-terminal tail domains of one H2A molecule and one H2B molecule are shown(dashed lines)with sites of ubiquitylation at H2A Lys119(most common in mammals)and H2B Lys123(most common in yeast).Modifications are shown on only one of the two copies of histones H3 and H4 and only one tail is shown for H2A and H2B.Sites marked by blue arrows are susceptible to cutting by trypsin in intact nucleosomes.The cartoon is a compendium of data from various organisms,some of which may lack particular modifications,“Code”regulates accessibility of DNA and transcription of genes,Language by which information about chromatin and underlying genes is conveyed to other protein complexes,Combinatorial,In general,acetylation is associated with active genes,H4K12 acetylation,heterochromatin in many organisms,Methylation associated with silenced genes,H3K4 methylation,euchromatin in many organisms,The Histone Code Hypothesis,蛋白质的可逆磷酸化作用,7.2.1,蛋白质的可逆磷酸化作用概述,蛋白质可逆磷酸化修饰是调控各种各样生物学功能的通用机制。,1955,年美国生化学家,Krebs E.G.,和,Fischer E.H.,发现糖原磷酸化酶的调节机制，并因此获得,1992,年诺贝尔生理医学奖。其后，人们陆续发现了许多受这种方式调控的生理生化过程，如基因的复制和转录，分子识别和信号转导，蛋白质的合成与降解，物质代谢与跨膜运输，细胞形态建成与肌肉收缩，细胞周期的运转，细胞增殖与分化，肿瘤发生以及包括学习记忆在内的高级神经活动等等。实际上，蛋白质的可逆磷酸化是许多信号转导途径实现其生物学功能的枢纽（图,7.1,）,。,7.2,蛋白质的可逆磷酸化作用,图,7.1,蛋白质可逆磷酸化在介导信号物质生物效应中的作用,光,血红素,多胺,生长因子,干扰素,甾类激素,cAMP,药物,肽类激素,神经递质,前列腺素,Ca,2+,药物,膜去极化,神经冲动,神经递质,激素,蛋白质,OH,蛋白质可逆磷酸化系统,ATP,蛋白激酶,ADP,P,蛋白质,蛋白磷酸酶,Pi,H,2,O,致癌病毒,多种生物效应,药物,神经递质,激素,前列腺素,cGMP,磷脂酰肌醇系统,1.,蛋白质可逆磷酸化作用的特点,原核细胞通过蛋白质可逆磷酸化进行调控的生理生化过程相对较少。随着生物进化，越是高等生物这种调节方式的使用越普遍，表明蛋白质可逆磷酸化作用具有显著的优势和特殊的重要性。这种调控方式至少具有以下特点：,（,1,）专一性强：,胞外信号经胞内信使控制蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性，通过对特定靶蛋白进行可逆的磷酸化修饰调节细胞生理过程，与别构调节相比显然较少受胞内代谢物的影响，能较专一地对胞外刺激作出准确的应答。,（,2,）级联放大效应：,信号转导过程包括一系列连锁反应，前面的反应对下一步的酶进行可逆磷酸化修饰，从而使微弱的原始信号逐级放大，同时级联系统各层次的可调控性增强了对生理生化过程的调控作用。,（,3,）节省而有效的调节：,可逆的磷酸化使被修饰的蛋白质激活或被,“,冻结,”,，在不改变蛋白质总量的情况下，只需消耗很少的,ATP,，就能有效地调节活性蛋白质的含量。与重新合成和分解相比，这种方式使细胞得以快速、有效、节省地对外界刺激作出反应。,（,4,）功能上的多样性：,蛋白质的磷酸化与脱磷酸化几乎涉及所有的生理过程，除调节酶活性这个主要功能外，有些蛋白质的磷酸化导致其亚细胞定位改变；此外从磷蛋白为胚胎发育提供营养到调控细胞的生长发育、分裂分化、基因表达甚至癌变，都有蛋白质可逆磷酸化的参与。可逆磷酸化的靶蛋白包括许多酶类、受体、膜上运输系统、结构蛋白、调节蛋白等其它功能蛋白。最近还发现某些功能蛋白被磷酸化后对其活性并无影响，称为,“,哑态,”,磷酸化。这类蛋白磷酸化后常常成为蛋白降解的靶子，因此推测磷酸化作用参与活性蛋白的灭活，成为某生理过程调节机制的一部分。,（,5,）持续的时效：信号引起的细胞效应中，有些是相当持久的，如细胞分裂、分化等过程。虽然胞内信号分子的寿命很短促，蛋白激酶一旦被激活，即通过自身磷酸化等方式把活性维持较长的时间，被它们磷酸化的靶蛋白则可更长久地维持其效应，直至被蛋白磷酸酶脱去磷酸。,（,6,）时空上的精确性：虽然受可逆磷酸化调节的蛋白质很多，但每种蛋白质的磷酸化修饰具有自己的细胞周期特异性、发育阶段周期性、种属和组织分布的特异性，从而呈现出特有的时空分布模式。这种分布上的广泛性与时空上的特异性相结合，构成了对生命过程更精确和更有效的调控。,2.,可逆磷酸化作用调节蛋白质活性的机制,通过可逆磷酸化向蛋白质大分子中引入或去掉一个或不多几个共价结合的磷酸基，可使其生物学活性发生戏剧性的转变，二者之间的关系可以归纳为以下几种：,单一部位磷酸化导致单一功能的变化，如肝细胞糖原磷酸化酶中,Ser14,被磷酸化之后即可从钝化状态变成活化构象，催化糖原的磷酸解。,多部位磷酸化导致单一功能的变化，肝细胞中的糖原合酶,Ser7,和,Ser10,分别被,AMPK,和,PKA,磷酸化而钝化。,(1),(2),多部位磷酸化分别导致不同功能的变化，如转录因子,STAT1,的单体为钝化状态，当被受体结合的,JAK,将其,Tyr701,磷酸化后，有了二聚化和核转位的能力再经一种,MAPK,将其,Ser727,磷酸化，才会充分活化，刺激靶基因的转录。,单一部位磷酸化导致多个不同功能的变化，如肝细胞中的果糖,6-,磷酸激酶,-2/,果糖,2,6-,二磷酸酶，,Ser32,的磷酸化导致激酶活性的钝化和磷酶酶活性的活化。,可逆磷酸化作用调节蛋白质活性的分子机制从目前研究的水平可从下述几方面予以说明：,(3),(4),（,1,）磷酸化导致蛋白质整体构象发生较大变化：磷酸化位点虽然远离活性部位，导入一个负电基团带来的结构信息经远距离的构象传导使得活性部位的构象发生巨大改变。许多别构酶的磷酸化位点在远离催化部位的,N-,端或,C-,端。例如肝细胞糖原磷酸化酶亚基由,842,个氨基酸组成，,N-,端结构域（,1,484,位）含有磷酸化位点（,Ser14,）、,AMP,和,ATP,等效应剂结合部位和糖原停靠部位；,C-,端结构域（,485,842,）,Lys680,共价连接一个辅因子磷酸吡哆醛，活性中心,Arg569,在结构域界面处。非磷酸化的二聚体是其钝化状态（,GP,b,），活化形式为磷酸化的二聚体（,GPa,），磷酸化的,Ser14,距活性中心约,3.5nm,。对,GPa,和,GP,b,晶体结构进行的解析表明，磷酸化之后引发了巨大的构象变化：,GP,b,的,N-,端形成两个,-,螺旋夹一个帽状结构（,1-cap-2,），位于亚基界面；磷酸化之后,Ser14