基因工程第三章基因工程的载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,苏州科技学院生物系 叶亚新,*,发展概况,1.第一阶段（1977年前）：,天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivar,et al,),2.第二阶段：,增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。,3.第三阶段：,进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第三章 基因工程的载体,作为基因工程载体的,基本功能,1.运送外源基因高效转入受体细胞,2.为外源基因提供复制能力或整合能力,3.为外源基因的扩增或表达提供条件,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第三章 基因工程的载体,作为基因工程载体必须具备的,基本条件,1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,3.长度尽可能小，以提高其载装能力,4.具有多种单一的酶切位点,5.具有合适的选择性标记,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,3.使用标记基因注意要点,1）标记基因与宿主细胞,2）标记基因产物的作用机制:Ap,r,3标记基因的结构与适用范围:基因启动子,翻译起始序列,密码子偏爱性,4）标记基因的结构变化对功能的影响:LacZ,GUS,4.常用的遗传标记基因,1),四环素抗性基因,（Tc,r,）,Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,2),氨苄青霉素抗性基因,（Ap,r,）,Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Ap,r,抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，催化内酰胺环的,水解,使氨苄青霉素失活。,3),氯霉素抗性基因,（Cm,r,）,Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cm,r,基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素,乙酰化,，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。,4),卡那霉素(Kan,r,),新霉素(Neo,r,)和G418抗性(G418,r,)基因,Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。来自转座子Tn5和Tn903的Kan,r,抗性基因均可使这类抗生素,磷酸化,，使之不能进入细胞内。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,5）,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ）,半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为,-互补作用,。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为,lacZ,(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。,半乳糖苷酶基因的优点:,a.酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观,b.lacZ编码5-端可容许很大的变化而不影响酶活性,c.lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,P LacZ LacZ,转录,翻译,LacZ基因的结构与产物,pUC18,Bam,HI片段,重组DNA分子 转化,E.coli,外源DNA,Bam,HI片段,涂布在含,X-Gal,和Ap的平板上,白色菌落为重组,子，,兰色菌落,为,原载体,利用LacZ基因筛选重组子,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,6）,葡萄糖苷酸酶基因（GUS）,该基因编码一种可分解各种-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。,7）,荧光素酶基因,荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（,Photobacterium fischeri,）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活,。,8）,发光蛋白质基因,发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落呈蓝色。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,分子克隆载体的复制起点与种类,1.复制起点的种类,1)核内复制起点,a.染色体复制起点原核生物(环状)和真核生物(线状)染色体,b.染色体外复制起点,i.质粒DNA,RNA,线状,环状,单链,双链,ii.病毒同上,细胞内和病毒颗粒内,2)核外复制起点a.线粒体所有真核细胞,b.叶绿体所有绿色植物细胞,原核与真核生物,两种质体中亦可能含有质粒,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,3.按复制起点划分克隆载体,1),质粒复制型,复制起点来自质粒或线粒体和叶绿体,2),ARS复制型,ARS（autonomus replicative sequence)，或称染色体复制型,3),病毒复制型,复制起点来自病毒，若为RNA病毒，必须反转录为cDNA。,4),混合复制型,a.同种生物复制起点混合质粒形式存在；质粒或病毒形式存在,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,例：大肠杆菌（,E.coli,）的,噬粒,（phagemid）载体既含有来自质粒的复制起点，又含有来自噬菌体（如M13）的复制起点。在不同条件下，它可以质粒或噬菌体的复制起点进行复制，从而获得质粒ds-DNA或噬菌体ss DNA,又如：酿酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）的某些载体既含有质粒（2）复制起点，又含有ARS片段,b.不同生物复制起点混合,穿梭载体,（shuttle vector）,两种生物中均以质粒形式存在；在一种生物中以质粒形式存在，在另一种生物中以质粒或病毒形式存在,*,穿梭载体范围,：细菌细菌（放线菌），细菌酵母菌，细菌真菌，细菌动物,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,pBS载体的结构,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,分子克隆载体的复制起点种类、标记基因与拷贝数的关系,1.复制起点种类与拷贝数间的关系,1)质粒复制起点类型：低拷贝（严紧型，1-2 copies，受宿主染色体基因控制）；高拷贝（松弛型，20 copies，受宿主染色体控制较弱）,2)ARS型载体：拷贝数较高（约20 copies）,3)病毒型复制起点：高拷贝,2.标记基因与拷贝数的关系,若标记基因表达效率高，宿主细胞可能不大量产生标记基因以满足选择压力要求，因而载体拷贝数会降低。对于不同标记基因，可采取相应方法提高其拷贝数如：对于药物抗性标记基因，可提高药物浓度。,对于营养标记基因，可降低该基因的表达效率或更换其他低效率的标记基因,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,分子克隆载体的转化频率和稳定性,1.影响转化频率的因素,1)复制起点类型：尽可能选择高拷贝复制起点,2)标记基因：尽可能选择高效表达的标记基因,2.影响稳定性的因素,1)复制起点类型低拷贝载体稳定，高拷贝载体稳定性差,2)选择压力,3)载体在宿主细胞中的状态自主复制型和整合型,宿主细胞的遗传特性和生理特性,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,1、定义,质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（Covalently closed Circular DNA,ccc DNA）,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,2、特征,自主复制性,质粒DNA携带有自己的复制起始区（ori）以及一个控制质粒拷贝数的基因，因此它能独立于宿主细胞的染色体DNA而自主复制,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,2、特征,不相容性,利用同一复制系统的不同质粒（RNAI RNAII Rop因子）如果被导入同一细胞中，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中，就会彼此竞争，几种质粒中只能有一种长期稳定地留在细胞中，这就是所谓的质粒不相容性。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,2、特征,可扩增性,pMB1或ColEI类质粒在蛋白质合成中断时，质粒复制能持续合成，这样当用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒将利用丰富的原料大量复制，最后每个细胞可以积聚2000-3000个拷贝，这叫做,氯霉素扩增,。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,2、特征,携带遗传标记,在实验室中将质粒通过物理方法导入受体细胞，但是即使在最佳条件下，受体细胞中也只有少数细胞能稳定地接受质粒，要想找到这些进入了质粒的受体细胞，就要利用载体质粒上的遗传标记，天然质粒上碰巧携带许多功能基因，它们便可被用作选择标记。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,一、质粒（plasmid）的一般性质,3、分类,接合型,和非接合型,严紧性和,松弛型,在基因工程中使用的质粒都是松弛型质粒,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,Ecoli,质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,1、理想质粒载体所具备的条件,质粒较小,质粒带有可供选择的标记,带有尽可能多的单一限制酶切位点,应有较高的基因表达能力,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节,E.coli,质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,2、质粒人工构建的目的,天然质粒往往存在着这样或那样的缺陷，因而不适合用作基因工程的载体必须对之进行改造构建：,（1）,加入合适的选择标记基因,，如两个以上，易于用作选择,（2）,增加或减少合适的酶切位点,，便于重组,（3）,缩短长度,，切去不必要的片段，提高导入效率，,增加装载量,（4）,改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝,（5）根据基因工程的特殊要求,加装特殊的基因元件,方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,多拷贝质粒,经过人工突变，除去控制拷贝数负调节基因，使质粒拷贝数达到每个细胞数千，用于扩增外源基因。,测序质粒,拷贝数高，加装测定顺序所必需的序列，如多切口接头，便于各种片段方便克隆,整合质粒,装有整合促进基因及整合特异序列，便于外源基因准确重组整合入受体细胞的染色体上,穿梭质粒,含有两个不同的复制子，能在两种不同的受体细胞中复制,表达质粒,装有强的启动基因，合适的顺序以及有效的终止子，以便任何外源基因在受体细胞内的高效表达探针质粒,筛选克隆或寻找基因元件，他通常装有一个可以定量测定其表达的标记基因，如抗性基因。筛选启动基因、终止子等。,人工构建的质粒根据其功能及用途分为：,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,3、人工组建克隆载体-pBR322,大小：4.3 kb,选择标记：Ap,r,Tc,r,单一酶切位点：,EcoR Hind BamH PstI Sal 等,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,3、人工组建克隆载体-pBR322,用于组建pBR322的,三个亲本质粒,的特征：,pSE2124：,Ap,r,基因,pMB8:,Col EI松弛型复制子,pSC101:,Tc,r,基因,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒,多拷贝大肠杆菌型质粒，包括pUC8/9 pUC18/19,pUC的亲本质粒是pBR322,包括如下四个部分：,来自 pBR322 的复制起点（ori）,来自pBR322的Ap,r,基因（核甘酸序列已发生改变）,E.coli的lacZ基因及其启动子组成lacZ 基因,lacZ内部人工组装了一个多克隆位点（MCS）,它含有如下单一酶切口：EcoRI、SstI、KpnI、SmaI、BamHI、XbalI、PstI、SphI、HindIII，。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,二、质粒（plasmid）载体的构建,4、人工组建克隆载体-pUC系列质粒,pUC系列质粒的优点,更小的相对分子量和更高的拷贝数,可用组织化学法检测重组体,具有多克隆位点（MCS）区段,是基因工程中目前最常用的E.coli克隆载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,三、质粒（plasmid）的制备,碱裂解法,（,1,）将菌体悬浮在含有,EDTA,的缓冲液体中,（,2,）加溶菌酶裂解细菌细胞壁,（,3,）加,NaOH,与,SDS,的混合溶液，去膜释放内含物,（,4,）加高浓度的醋酸钾溶液沉淀染色体，去除染色体,DNA,及大部分蛋白质,（,5,）离心取上清液，用苯酚氯仿溶液处理，灭活去除痕量蛋白质及核酸酶,（,6,）乙醇或异丙醇沉淀水相质粒,（,7,）无,DNase,的,RNase,处理残余,RNA,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第一节 E.coli 质粒载体,三、质粒（plasmid）的制备,沸水浴法,（,1,）将菌体悬浮在含有,EDTA,和,Triton X-100,的缓冲液中,（,2,）加溶菌酶破细胞壁,（,3,）放入沸水浴中煮,40,秒,（,4,）离心，用无菌牙签挑去沉淀物,（,5,）乙醇异丙醇沉淀,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,一、Ti质粒载体,1.,根癌农杆菌(,Agrobacterium tumefaciens,)与Ti质粒,G,-,菌，可侵入90科双子叶植物受伤组织，形成冠瘿瘤(crown gall tumor)。冠瘿瘤细胞具有以下特征：,i.不需要补充植物激素便可进行离体培养,ii.合成肿瘤特有的化合物冠瘿碱(opine)，能专一 的为根癌农杆菌所利用.这两个特征由Ti质粒决定，但该质粒中仅有一部分进入植物细胞。,三、其他质粒载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,1),Ti 质粒类型,（由Ti 质粒所产生的冠瘿碱种类而定）,i.鱆鱼碱类(octopine),ii.胭脂碱类(nopaline),iii.农碱类(agropine),2),Ti,质粒的结构,i.环状ds-DNA,160-250kb，具六个功能区,i)致瘤区：合成植物生长素和细胞分裂素,ii)冠瘿碱合成区：参与冠瘿碱合成,iii)冠瘿碱分解区：参与冠瘿碱分解,iv)Ti 质粒转移区(tra)：参与不同农杆菌中的接合转移,v)毒（性）区：参与T-DNA的转移和插入植物染色体,vi)DNA复制区：参与Ti 质粒DNA复制,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Ti,质粒的结构,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,ii.,T-DNA,T-DNA包括植物激素冠瘿碱合成区基因及两侧相同的25 bp重复序列，T-DNA整合不具特异性，右侧25 bp重复序列对T-DNA的转移至关重要。,不同Ti 质粒中的T-DNA结构是不相同的，其中,i)胭脂碱Ti 质粒的T-DNA长23bp,结构连续，具13个基因,ii)鱆鱼碱Ti 质粒中的T-DNA不连续，分左右两段，分别称之为T,L,和T,R,T,L,DNA长13.2 kb,含8个基因，包括鱆鱼碱合成酶和植物激素合成基因,T,R,DNA长7.9 kb，含5个基因，参与甘露碱(mannopine)和农碱合成,iii,)两者同源性：主要集中在植物激素合成区。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Ti,质粒的,T-DNA,的同源性,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,2.,Ti质粒载体,1),Ti质粒作为载体的问题,i)太大，无适合克隆位点,ii)T-DNA的存在不能使转化细胞再生为完整植株,2),载体类型,i)中间载体(intermediate vector),由以下几部分组成：,适合于,E.coli,和,A.tumefaciens,自主复制和选择用标记基因,适合于植物细胞选择用标记基因,一段来自天然,Ti,质粒的部分,T-DNA,序列（提供同源重组）,1-2,个来自,T-DNA,的,25bp,重复序列,用于表达外源基因的,DNA,序列（如启动子、终止子序列,）,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,重组DNA的转移过程,：,中间载体或重组子,E.coli,(中宿主),A.tumefaciens,在根癌农杆菌中与天然Ti质粒或非致瘤质粒发生,共整合作用,感染植物受伤组织或与植物细胞共培养,T-DNA进入植物细胞并整合到染色体DNA中 外源基因表达,转化,接合,转移,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,根癌农杆菌中,Ti,质粒的转移,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Ti,质粒衍生的植物克隆载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,二、,酿酒酵母(,Saccharomycea cerevisiae,)的分子克隆载体,1.克隆载体的种类,1),按复制方式划分,i.,自主复制型；,ii.整合型（非自主复制型）Yeast Integration plasmid(,YIp,),2)按复制子来源划分,i.附加体型-yeast episomal plasmid(,YEp,)，其复制起点来自于酿酒酵母的天然质粒-2质粒,ii.染色体复制型-Yeast Replicating plasmid(,YRp,)，其复制起点来自染色体上的自主复制序列(ARS-autonomous replicating sequence),三、其他质粒载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,酿酒酵母载体的种类和构建,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,*若在YRp中插入酿酒酵母的着丝粒序列，该种载体,YCp,-Yeast Centrometric plasmid,*若在YCp 或YRp 中插入一段酵母的端粒结构，该质粒称之为,YLp,-Yeast Linear plasmid,*若将YLp质粒构建成环状分子,该质粒称之为,pYAC,载体(Yeast Artificial Chromosome),3)标记基因,大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如,ARG4,，,LEU2,，,TRP1,，,HIS3,和,URA3,。,使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的，重组子则是靠在,E.coli,的转化体中来鉴别的。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,2.酵母克隆载体的结构与特点,1),穿梭载体，YIp除外,2),有适合两种生物的标记基因,3),环状或线状DNA,详见下表,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,载体类型 存在方式 所需DNA序列 标记基因 转化频率 稳定性,（菌落/gDNA）无丝分裂 有丝分裂,整合型,整合 与染色体DNA Ap,r,Tc,r,10 +,a,+,a,(YIp5)1-几个拷贝 同源,URA3,附加体型,自主复制 2质粒 Ap,r,Tc,r,10,3,-10,4,-,b,-,c,(YEp13)多拷贝,LEU2,复制型,自主复制 ARS Ap,r,Tc,r,10,3,-10,4,-,b,-,c,(YRp7)多拷贝,TRP1着丝粒型,染色体状 ARS,CEN Ap,r,10,3,-10,4,+,d,+,d,(YCp19)通常单拷贝,TRP1,URA3,线型,染色体状 ARS，CEN,TRP1，HIS3,10,3,-10,4,+,e,+,(YLp21)通常单拷贝 TEL,a.每次细胞分裂仍有约1%的载体DNA从染色体上脱落下来,b.在选择培养基中15-20代后，10-30%的转化子丢失载体DNA,c.非孟德尔式分离，主要是4,+,：0,-,d.无丝分裂时有3-14%转化体丢失质粒，有丝分裂时有3%转化体质粒不发生分离,在选择培养基上丢失质粒的转化体低于1%,酿酒酵母各种载体的特征,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,3.YEp载体,1)酵母,2,质粒,i.结构,ii.,结构特点,2,质粒的结构,2质粒倒置区的,同向和反向重复片段,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,2）,2,质粒载体,YIp中可插入整个或部分2质粒DNA构成YEp。大多数酿酒酵母菌株中都含有2质粒，YEp复制所需的酶可由2质粒提供。,YEp具有YRp载体相同的特点，它还可以与2质粒发生重组。重组质粒不稳定，在无选择压力条件下可很快消失。利用此特点可除去酵母菌株中的天然质粒，即Cir,+,Cir,o,当YEp进入宿主细胞后，其转化体内所含DNA可得如下杂交图谱（设,YEp,为8 kb，,Bam,HI有一单切点）,1-YEp13 探针;2-2质粒探针;3-LEU2探针;4-pBR322探针,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,4.pYAC载体,酵母菌人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)广泛用于构建高等动植物基因组文库的构建,由YLp经适当改造后构建成pYAC载体。,pYAC载体具有以下特点：,1）,双TEL位点；,2）,三个酵母菌遗传标记基因；,3）,一个SUP4基因用于检测重组子,，其原理是：SUP4是tRNA,tyr,的赭色抑制突变基因，但把该基因转入酵母菌的ade2赭色突变体时，宿主菌为白色菌落，要是在SUP4基因中插入外源DNA片段后在转化ade2宿主菌，转化子成红色菌落。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,YAC:酵母人工染色体,（yeast artificial chromosome）,目前能容纳最大外源DNA片断的载体.,YAC载体有两个臂，每个臂的末端有一个端粒（TEL），臂上有着丝粒（CEN）、自主复制序列（ARS）、选择标记（TRP1和URA3）,装载容量：50Kb-2000Kb,YAC载体是以质粒的形式出现，如：pYAC2,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,pYAC载体的结构,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,一、l噬菌体的分子生物学,l噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和l DNA组成,1.l-DNA的物理图谱,l-DNA为线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端），称为cos区，全长48.5kb。左边是外壳蛋白的基因，右边是负责裂解宿主细胞，DNA自主复制以及调控基因，中间是负责与宿主染色体DNA遗传重组整合的基因,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI,cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏,DNA合成 溶菌,生长非必须区段,cI基因：溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,5-CGGGGCGGCGACCTCG-3,3-GCCCCGCCGCTGGAGC-5,Cleavage Ligation,(during packaging)(after infection),GGGCGGGCGACCTCG-3,5-CG +GC-5,3-GCCCCGCCGCTGGA,The phage,cos ends,Circular form,Linear form,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,一、,l,噬菌体的分子生物学,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,溶源阶段,(整合到寄主染色体上),48.5 kb in length,Linear or circular genome(,cos,ends,),phage,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,二、l噬菌体载体的构建,天然的lDNA由于包装上下限的存在以及同种酶切口太多不适合作为重组实验的载体,1.缩短长度,野生型lDNA包装的上限为50.9kb，本身长度为48.5kb，那么外源DNA片段允许插入的大小至多为2.4kb，这样才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒，如果将缩短便提高装载量。其实lDNA上约有40-50%的DNA片段（J-N区间）是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,二、l噬菌体载体的构建,缩短长度,插入型载体,该类载体经改造后的长度为,37kb,，,有单一酶切位点，便于外源,DNA,的插入。其允许插入片段最大为,13.9kb,。,根据插入失活效应的特异性分为两种亚型：,免疫功能失活插入型载体,半乳糖苷酶失活插入型载体,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,插入式载体：,cI,基因插入失活：,如,gt10,、,NM1149,等载体，在,cI,基因上有,EcoR,I,及,Hind III,的酶切位点。外源基因插入后将导致,cI,基因的失活。,cI,基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。,Lac Z,基因插入失活：,如,charon16A,载体，在非必须区段引入,lac,Z,基因，在,lac,Z,基因上有,EcoR,I,位点，插入失活后利用,X-gal,法筛选（兰白筛选）。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,cI,EcoR I,LA 32.7,RA10.6,gt 10,lac Z,LA 19.9,RA21.9,EcoR I,Charon,16A,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,二、l噬菌体载体的构建,缩短长度,替换型载体（取代型载体）,该类载体经改造后的长度约为,40kb,，,但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如,EcoRI,、,HindIII,、或,salI,），,两者间的距离为,14kb,长，使用时用酶切开，分离去除这个,14kb,长的,DNA,片段，然后用外源,DNA,片段取代之。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Lac,5,EcoR I,EcoR I,EcoR,I BamH I Sal I Sal I BamH I EcoR I,Charon 4A,EMBL3/4,Charon,40,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,二、,l噬菌体载体的构建,删除重复的酶切口,插入型载体在插入位点有一酶切口，但这必须是唯一的；,取代型载体在取代位点有两个酶切口，多了也不行,天然的,l-DNA,上有许多重复的酶切口，如：,EcoRI,5,个，,HindIII,7,个，这些多余的酶切口必须被删除。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,二、,l,噬菌体载体的构建,构建,琥珀型密码子突变体,终止密码子有三种：,UAA,（,赭石）；,UGA,（,乳白）；,UAG,（,琥珀）,琥珀型突变：,CAG-UAG,（,stop,）,将野生型,-DNA,上,A,和,B,两个头部包装蛋白的基因中的,CAG,密码子突变成,UAG,，,当这种,l-DNA,进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的,A,和,B,头部蛋白，也就,不能被包装，不能裂解细菌,。,阻止有害重组体的生物污染及扩散,，而基因工程实验中用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第二节 噬菌体载体,三、,l,-,DNA作为载体的优点,l,-,DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌,l,-,DNA,作为载体，其装载外源,DNA,的能力为,25kb,，,远远大于质粒的装载量,重组,l,-,DNA,的筛选较为方便,4.,重组,l,-,DNA,分子的提取比质粒容易,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第三节 Cosmid载体,一、,Cosmid的定义,Cosmid,（cos sitecarrying plasmid）,：,是一类由人工构建的含有,l,-DNA两端cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,。,质粒复制子包括：一个复制起点和两个抗性基因,Ap,r,、Tc,r,。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Cosmid,载体的特点,具有,噬菌体的特性；,具有质粒载体的特性；,具有较高容量的克隆能力；,具有与同源性序列的质粒进行重组的能力,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第三节 Cosmid载体,二、,Cosmid的构建,Cosmid含有,l,-DNA两端cos区的质粒。由于,l,-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端附近的一小段顺序，均1.5kb长。如果将这一小段DNA与质粒连在一起，则这个重组质粒就可装载更大的外源DNA片段，同时它仍可象,l,-DNA一样，在体外被包装成有感染活性的噬菌体颗粒，并高效感染大肠杆菌，与噬菌体DNA所不同的是，,Cosmid不能在体内被包装，更不能裂解细胞,，它的制备与质粒相同。进入细胞后，通过质粒上的复制子进行复制。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第三节 Cosmid载体,三、,Cosmid的优越性,1.能象,l,-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞,2.可以装载比质粒或l-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该,Cosmid最大可装载45.9kb的外源DNA,3.由于携带质粒的选择标记便于筛选,4.由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,采用,Cosmid,作载体的困难,载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,第四节 单链DNA噬菌体M13,一、M13单链噬菌体的分子生物学,M13是一种单链DNA噬菌体,，总长6407bp，闭合环状正链ssDNA。,噬菌体首先吸附大肠杆菌的雄性鞭毛上，然后穿过鞭毛内孔将DNA注入细菌体内。,单链DNA利用宿主细胞的复制另一条链（负链），形成dsDNA（RFDNA）,，故M13能以dsDNA的形式从细胞中分离作为克隆载体,宿主细胞不会发生裂解,。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,M13单链DNA噬菌体的生命周期,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,RF DNA,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Phage M13 replication in the host cell:,+,RNA,pol,DNA,pol,III,RF,Nicked by gene 2 protein,+,ss-Rolling circle replication,then cut and ligate,Coated with,gene 5 protein,Gene 5 protein is replaced by gene 8 protein ect.,Linear M13 phagereleased from the cell.,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,M13载体,具有多克隆位点,(MCS),，,方便克隆。许多,M13,载体的多克隆位点与质粒载体,pUC,序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择上更为方便。,可以定向地克隆,DNA,片段，克隆在,M13 RF DNA,分子上的双链,DNA,片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分离分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据,M13,的生物学特性知道，,M13,子代噬菌体中总是只含有（）链，所以,M13,载体克隆的外源,DNA,片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA,分子中的哪条链，则完全取决于外源克隆时的取向。这样一来，为分别分离外源分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问题的一个行之有效的方法就是定向克隆技,术。,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Blue-white selection,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,Blue-white selection,10/19/2025,苏州科技学院生物系 叶亚新,M13mp18 MCS M13mp19 MCS,EcoRI BamHI HindIII PstI BglI BglI PstI HindIII BamHI EcoRI,B P,P B,B P,B P B