第五章-植物人工繁殖.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,公司,徽标,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 植物人工繁殖,生物科学与技术学院,兰花组织培养：,一个组织培养成功产业化的植物。珍稀而名贵的,达摩兰,等名贵兰花，如今已成市井之花。一株不过百元。,脱毒植物的培育：,土豆，,第二面包,，,植物之王”，热量低于谷类粮食是理想的减肥食物和玉米小麦水谷类粮食，是理想的减肥食物，和玉米、小麦、水稻、燕麦被称为世界五大粮食作物。,传统途径存在的问题？,为什么要采用组织培养？,视频,重要知识回顾,1,、,细胞全能性,：是指分化细胞保留着全部的核基因组，具有生物个体生长、发育所需要的全部遗传信息具有发育成完整个体的潜需要的全部遗传信息，具有发育成完整个体的潜能。,2,、,细胞分化,：是指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。同一种类型的细胞经细胞分裂后，逐渐在形态结构和生理功能上形成稳定性的差异，产生不同的细胞类群的过程。,3,、,脱分化,：也称去分化，是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程，即分化的细胞在适当条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生无组织结构、无明显极性的松散的细胞团，称之为愈伤组织。,4,、,再分化,：是指在离体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。,5,、脱分化是细胞全能性表现的前提，而再分化是最终体现，是再生的基础。,第一节 植物人工繁殖,植物,外植体,愈伤组织,单细胞,体细胞胚,激素调控,器官发生,胚胎发育,再生植株,人工种子,植物人工繁殖的主要目的是为了克服自然,有性生殖,的不足，满足对优良植物的大量需求。,植物人工繁殖通过,无性繁殖,的组织培养、人工种子、胚胎培养等技术实验植物快速繁殖。,愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。,第二节 植物组织培养,植物组织培养是将植物,器官,、,组织,、,细胞,或,原生质体,等（属于外植体）在无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。,外植体：主要指用于离体培养的植物或组织切段或组织切段。不同植物品种的取材部位和发育阶段不同。通常为生长点或幼嫩组织。,植物组织培养的应用,1,、脱毒和离体快速繁殖,（,1,）种苗脱毒：可以有效地培育出大量的无病毒种苗。,很多农作物如马铃薯、甘薯、大蒜等都带有病毒，但感病植株并非每个部位都带有病毒，,White在,1943,年就发现植物生长点附近的病毒浓度很低甚至无病毒。,利用组织培养方法，取一定大小的茎尖进行培养再生可获得脱病毒苗，再用脱毒苗进行繁殖，则种植的作物就不会或极少发生病毒。,目前已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。,（,2,）离体快速繁殖：,运用组织培养法繁殖植物的明显特点是快速，每年可以数百万倍的速度繁殖。,对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的名、优、特植物品种的繁殖意义尤为重大。,观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖等作物等部分或大部分都用离体快繁提供苗木，试管苗已出现在国际市场上并形成产业化。,植物组织培养的优点,1,、周期短，便于人工控制培养条件，繁殖速度快，经济效益高。,2,、占用空间小，不受地区、季节限制限制。,3,、繁殖珍稀、濒危苗木和突变体是优良品种培育的有效途径。,4,、利于保持原来品种的特性。,植物组织培养,-,植物细胞脱分化与再分化,细胞分化：,同一种类型的细胞经细胞分裂后，逐渐在形态结构和生理功能上形成稳定性的差异，产生不同的细胞类群的过程。,脱分化：,分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。,再分化：,在离体条件下，无序生长的脱分化的细胞在适当条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。,脱分化,分裂,再分化,成熟细胞,分生细胞,愈伤组织,器官发生,再生植株,脱分化,再生,细胞分化,细胞分裂和分化组成植物体,人工脱分化和再分化诱导再生植物体,脱分化,再分化,植物组织培养,-,植物脱分化,脱分化,分裂,再分化,成熟细胞,分生细胞,愈伤组织,器官发生,再生植株,再生,植物的成熟的已分化的细胞通过植物激素的诱导进入脱分化过程并形成愈伤组织。此过程经历三个阶段：,1,、诱导期：细胞形态如多大变化，胞内代谢水平上升，,RNA,迅速增加，胞核体积增大,2,、分裂期：细胞数量迅速增加，细胞体积小，胞核增大,3,、形成期：细胞大小平均，形成分生组织结节和维管组织结节,植物组织培养,-,植物再分化方式,脱分化,分裂,再分化,成熟细胞,分生细胞,愈伤组织,器官发生,再生植株,愈伤组织,的形态发生方式主要有,不定芽方式（器官发生）,和,胚状体方式,两种。,1,、,不定芽方式,是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的,器官原基,，再逐渐形成芽和根。,2,、,胚状体方式,是由愈伤组织细胞诱导分化出具有,胚芽、胚根、胚轴的胚状结构,，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。,器官发生途径（不定芽）,胚状体发生或无性胚胎发生途径,再生,影响植物细胞脱分化和再分化因素,内部因子：植物的遗传性状、生理状况。,外部因子：营养条件（植物激素、无机盐、有机营养成分等）、环境条件（培养基的,ph,、渗透压、温度、湿度、光照等）。,不同程度的影响植物细胞脱分化、再分化及器官建成的各个过程。,植物生长物质的添加量,生长素,(mg/L)3 3 0.03 0,细胞分裂素,(mg/L),0.2 0.02 1 0.2,当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。,愈伤组织再分化过程应先诱导生芽，再诱导生根,植物组织培养,-,植物组织的再生方式,脱分化,分裂,再分化,成熟细胞,分生细胞,愈伤组织,器官发生,再生植株,不定芽型,器官型,器官发生型,胚状体发生型,原球型,再生,再生方式,1,、不定芽型：,不定芽,：在高等植物正常的个体发育中，芽一般是只从茎尖或叶腋等位置生出。这种芽称为,定芽,。与此相反，凡从叶、根、或茎节间或是离体培养的愈伤组织等部位生出的芽则统称为,不定芽,。,不定芽型,是指诱导,顶端分生组织,产生不定芽，再生成植株的方式。即选取已经发育成熟的顶芽和腋芽，连同它们的短枝经表面消毒后，在无菌条件下培养，诱导不定芽并使其生根形成植株的方式。,特点：不仅繁殖率高，利用外植体原有的芽，包括隐芽在内繁殖数量大，同时能保持该物种的遗传稳定性，只要有明显的顶端分生组织和次生分生组织的植物均适用。,不定芽,2,、器官型：,从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式。即选取充分发育的器官诸如茎、叶、花器、鳞片等，经离体培养而产生植株的方式。,如烟草、大蒜、甘蓝的花茎培养诱导不定芽；,水仙、百合、风信子、贝母的鳞片培养诱导不定芽；,亚麻的下胚轴培养诱导不定芽；虎眼万年青的任何一部分均可诱导不定芽。,特点：遗传性也比较稳定，但繁殖速度慢。,3,、器官发生型,从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式。,如甘蔗、水稻、小麦，百合、小苍兰、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕榈等常以器官发生型方式再生植株。,特点：繁殖速度快，由于经愈伤组织而再生植株，遗传性不稳定。,4,、胚状体发生型,由植物器官、组织和细胞培养而直接发生类胚体结构，最后以,胚状体,成苗的方式。,胚状体：,离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。,在被子植物中有胚状体发生的植物已达,100,余种，分属近,40,个科。,特点：遗传性一致，有些植物体细胞发生数量也相当大。如胡罗卜,1L,培养基有,10,万个以上的胚状体。,5,、原球茎型,种子萌发时先是胚的膨大，种皮破裂，,40,天时肉眼可见浅黄色的原胚呈球状，称为,原球茎,。,原球茎结构为,短缩的、珠粒状的、胚性细胞、类似幼茎的器官，可增殖、形成原球茎丛。,兰属植物特有的器官发生方式。种子消毒后，在培养基上播种，经一段时间培养而发生原球茎，然后由原球茎直接长成植株。,几种器官发生方式的优点、缺点比较,（,1）不定芽型容易成苗，对培养基要求不高，后代遗传性较为稳定，但取材受到一定的限制，仅限于具有明显顶端分生组织和次生分生组织的物种；,（2）器官型和胚状体发生型，对培养基要求高，器官发生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官发生型多，但遗传性稳定；,（3）器官发生型成苗数量大，对培养基要求不算高，容易调配。但由于是通过愈伤组织成苗，细胞的染色体容易发生数量和结构变异，很难使再生植株群体保持稳定的遗传性,。,植物组织培养,-,植物组织的再生途径,脱分化,分裂,再分化,成熟细胞,分生细胞,愈伤组织,器官发生,再生植株,再生,器官发生途径,体细胞胚发生途径,再生途径,1,、器官发生途径,（,1,）启动期：,通过向培养基中添加一定浓度、种类和比例的外源激素刺激外植体细胞改变原来的代谢途径来诱导细胞活化，重新获得分裂能力。,需要选择合适的较高浓度的生长素诱导剂（如,NAA,、,IAA,、,2-4D,等）或细胞分裂素启动诱导外植体细胞脱分化和分裂。,（,2,）愈伤组织诱导：,细胞开始分裂并不断增生子细胞的过程。这个阶段一般需要降低激素浓度，有些情况下甚至不需要生长素和分裂素。,（,3,）拟分生组织的形成：,将愈伤组织转移到有利于有序生长的条件下培养细胞内部开始发生系于有序生长的条件下培养，细胞内部开始发生一系列形态和生理变化，分化出形态和功能不同的细胞。在若干部位出现类似形成层的细胞群，通常称为“生长中心”，又可称为“拟分生组织”，该过程是器官发生的一个转变时期。,（,4,器官原基和器官的形成：,拟分生组织形成后，一些细胞分化成为管状细胞，进而形成维管组织形成不同的器官原基进步分化出相应的组织，形成不同的器官原基，进一步分化出相应的组织和器官。,体细胞胚发生途径,体细胞胚又叫胚状体，指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎。,体细胞胚发生途径：指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。包括器官外植体直接发生途径，悬浮细胞途径和愈伤组织途径。,体细胞胚起源于非合子细胞，因此不同于合子胚。,1,、器官外植体直接发生途径,茎表皮、叶、子叶、下胚轴等外植体分化细胞经过脱分化后均可以产生胚状体。一般经过两个阶段：,1,）诱导期。叶片表皮细胞或亚表皮细胞感受刺激后进入分裂状态，形成小的瘤状突起；,2,）胚胎发育期。瘤状物继续发育，经过球形胚、心形胚等阶段最后形成体细胞胚。,2,、悬浮培养细胞发生途径：,在悬浮培养的细胞中一些细胞可以产生胚性细胞团，一个胚性细胞团可以发育成一个胚状体，也可以产生多个胚状体。,3,、愈伤组织发生途径：,愈伤组织内部或表面细胞均可以产生胚状体。,包括三个阶段：,1,）诱导外植体形成愈伤组织；,2,）诱导愈伤组织胚性化；,3,）体细胞胚形成。,分生组织,/,胚状体,脱分化,再分化,（分化）,幼芽或幼根,条件？,优点？,特点？,繁殖速度快,不受季节限制,幼苗无毒,保持优良性状,适宜温度、无光照、,pH,和无菌环境。,无机、有机成分和植物激素（,生长素，细胞分裂素和赤霉素,）,无定形状态,薄壁细胞,高度液泡化,排列疏松、无规则,分化程度低,脱分化较易,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,外植体,植物体,再生,植物组织培养的问题分析,1,、玻璃化问题,植物组织培养中，常会出现一些半透明状的畸形试管植物，这类植物体被称为“玻璃苗”，这种现象称为玻璃化现象，又称过度水化现象。,由于玻璃苗的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，移栽大田更难成活。,玻璃化已成为组培的大问题。组织培养过程中试管苗的玻璃化现象主要是试管苗不能很好适应培养基和培养环性的生理问题。,2,、褐变问题,褐变可分为酶促褐变和非酶促褐变。,酶促褐变是由多酚氧化酶引起的。当外值体处于机械损伤等逆境时，细胞膜的结构遭到破坏，多酚氧化酶催化多酚类化合物，使其发生氧化形成棕褐色的醌类物质和水；醌类物质经过非酶促聚合，形成黑褐色物质,(,羟醌与黑色素等,),，引起褐变的发生。,3,、微生物污染,造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和内源菌。,外部污染菌主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。内源菌引起的污染与外植体的种类、取材季节、部位、预处理及消毒方法等密切相关。,应该严格按照无菌操作，取材时应选择嫩梢、新芽或胚作为外植体材料，对外植体进行彻底消毒。,4,、品种限制,目前，裸子植物组织培养成功的比较少。主要原因是裸子植物很难脱分化诱导成具有全能性的细胞。对细胞脱分化能力不同，决定了组织培养再生的难易。,植物组织培养技术,-,培养基技术,培养基的组成,无机盐,有机物,调节物质,其他物质,糖类,氨基酸,维生素,醇类,植物激素,生长素,细胞分裂素,赤霉素,1,、无机盐,培养基中无机盐的浓度通常在,25mmol/L,左右。,根据添加量多少分为大量元素,(,浓度大于,0.5mmol/L),和微量元素,(,浓度低于,0.5mmol/L),。,大量元素主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。,微量元素主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。,微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要并参与生物过程的调节分重要，并参与生物过程的调节。,2,、有机物,（,1,）糖类,糖是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持渗透压。,最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。,（,2,）氨基酸,氨基酸是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。,培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。,通常采用蛋白质水解产物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。,（,3,）维生素,维生素以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有促进作用。,大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上不足，通常需加入一至数种维生素。,常用的维生素包括盐酸硫胺素（,VB1,）、盐酸吡哆醇（,VB6,）、抗坏血酸（,Vc,）、烟酸（,Vpp,）、生物素（,Vh,）、泛酸钙、叶酸等。,VB1,对愈伤组织的产生和生活力有重要作用；,VB6,能促进根的生长；,Vc,有防止组织变褐的作用。,（,4,）肌醇,肌醇对糖类的相互转化有促进作用。,肌醇能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成，对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,腺嘌呤是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞合成分裂素，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。,3,、调节物质,（,1,）植物激素,植物激素是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。,植物激素能影响植物的生长和分化。,在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个器官成熟过程都主要由激素控制。,植物体内的激素与细胞内某种称为激素受体的蛋白质结合后，影响,DNA,、,RNA,和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代对特殊酶的合成起调控作用从而表现出调节代谢的功能。,（,2,）生长素,生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。,在植物组织培养中，生长素主要用来刺激细胞分裂和诱导根的分化。,常用的生长素有吲哚乙酸（,IAA,）、,2,，,4-,二氯苯氧乙酸（,2,，,4-D,）、萘乙酸（,NAA,）、吲哚丁酸（,IBA,）等。,IAA,能促进生长区细胞的分裂和非生长区细胞的伸长，诱导根系的发生，促进雌花的分化及果实的形成。,NAA,和,IBA,广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2,，,4-D,起动能力比,IAA,高,10,倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。,（,3,）细胞分裂素,细胞分裂素大多是嘌呤族衍生物。,自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。,分裂素的生理作用主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大。,分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。,分裂素主要有,6-,呋喃氨基嘌呤（激动素,KT,）、,6-,苄基腺嘌呤（,6-BA,）和玉米素（,ZT,）等。其中最常用的是,6-,苄基腺嘌呤。,ZT,活性最强，但昂贵。,激素配比,生长素,/,细胞分裂素,高,适中,低,有利于根的形成和愈伤组织的形成,有利于根芽的分化,有利于芽的形成,培养基分类,1,、富盐平衡培养基,目前使用最广泛的一类，代表性的培养基有,MS,、,LS,、,BL,、,BM,、,ER,等。,特点：无机盐浓度高，微量元素种类齐全，浓度高；元素间比例适当，离子平衡性好，具有较强的缓冲能力、稳定性好、营养丰富，一般培养时无需再加入有机成分。,2,、高硝态氮培养基,代表性培养基有,B5,、,N6,、,SH,。,特点是：硝酸钾浓度高，氨态氮浓度低，含有较高浓度的硫胺素（,VB1,）。,3,、中盐培养基,代表性培养基有,Nitsch,、,Miller,、,Blaydes,、,H,。大多是在,MS,培养基基础上进行改良设计。,特点是：大量元素无机盐为,MS,的一半，微量元素种类减少、含量增高。维生素种类比,MS,增多，例如增加了生物素、叶酸等。,4,、低盐培养基,代表性培养基有,White,、,WS,、,HE,、,HB,。,特点是：无机盐有机成分含量浓度低多用作生根培养的培养基无机盐、有机成分含量浓度低，多用作生根培养的培养基。,1,、加热溶解；分别加入各种储存液，包括生长调节物质和其他特殊补加物；,2,、称取规定数量的琼脂和蔗糖，加水至培养基最终容积的,3/4,。,3,、加蒸馏水至培养基的最终容积；混合后调节,ph,；,4,、分装培养基；用棉塞封口；,5,、高压灭菌；培养基室温冷却，至,4,冰箱中保存。,培养基制备过程,实验材料必须严格清洗，清洗过程勿伤实验材料。,对一些特殊的植物材料需要特殊的处理。,表面具较厚蜡质和角质层的，灭菌剂不易粘着，可加入少量表面活性剂。,外植体在接种之前，须经严格地灭菌。,对器官外植体的灭菌，一般采用多种清洗药剂配合使用的方法。,清洗药剂灭菌法适用于培养材料的表面消毒。,选择消毒剂，既要考虑具有良好的消毒杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或能自行分解的物质，且不会损伤或只轻微损伤组织材料而不影响生长。,在使用不同的药剂时，需要考虑使用浓度和处理时间。,植物组织培养技术,-,灭菌技术,不同器官的灭菌,1,、茎尖、茎段及叶片等的消毒：用清洁剂清洗,70%,酒精浸泡,10-20min,无菌水洗,2-3,次,Naclo,或升汞溶液泡,10-15min,无菌水洗,3-4,次。,2,、果实和种子的消毒：自来水冲洗,10-30min,70%,酒精漂洗,2%Naclo,液浸,10min,无菌水,2-3,次,取出种子培养。,3,、根及地下部器官的消毒：自来水冲洗,纯酒精漂洗,升汞浸,5-10min,或,2%Naclo,液浸,10-15min,无菌水洗,3,次。,4,、花药的消毒：,70%,酒精浸泡数秒钟,无菌水洗,2-3,次,漂白粉上清液浸,10min,无菌水洗,2-3,次。,接种是按照不同的要求将培养物移至灭菌的培养基上培养的过程。,接种过程必须严格进行无菌操作一防止杂菌污染。,接种的操作步骤,1,、玻璃瓶加消毒液消毒，摇动玻璃瓶,2-3,次，后无菌蒸馏水清洗，,3-4,次,2,、消毒所有使用的器械，蘸入,70%,酒精，取出火焰灼烧，冷却后可用，每次使用后消毒一次。,3,、用消毒后的器械切取适当外植体，放置于无菌培养皿的培养基上，移入培养室培养。,植物组织培养技术,-,接种技术,切取,接种,愈伤组织的形成,分化形成小芽或根试管苗的形成,移栽,经典的植物人工繁殖过程,消毒,人工种子：又称合成种子或体细胞种子，是指将植物离体培养中的胚状体或芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中形成的类似种子的颗粒。,结构上从外向里包括三部分：,（,1,）人工种皮外层：保护胚状体中的水分免于丧失和防止外部力量冲击；,（,2,）人工胚乳：含有的水分免于丧失和防止外部力量冲击；含有必需的营养成分和某些植物激素；,（,3,）胚状体或芽。,第二节 人工种子,植物,外植体,愈伤组织,单细胞,体细胞胚,激素调控,器官发生,胚胎发育,再生植株,人工种子,诱导植物愈伤组织,体细胞胚的诱导,体细胞胚的成熟,体细胞胚的机械化包裹,贮藏或种植人工种子的优点,（,1,）便于运输和储藏（相对于试管苗）。,（,2,）人工胚乳可根据不同植物的要求配制，通过加入植物激素、有益微生物或抗病抗虫成分，使人工种子优越于天然种子。,（,3,）可以固定杂种优势，加速良种繁育。,（,4,）可作为植物基因工程和遗传工程的载体。,（,5,）可保存珍贵稀有植物品种。,（,6,）大规模繁殖植物（尤其是没有种子和种子昂贵的植物）,关键技术问题,1,、胚状体同步发育,高质量和高数量的胚状体是大量制备人工种子的基础。,控制胚状体发育的同步化是人工种子制备的核心技术之一，主要方法如下：,（,1,）抑制剂法：在细胞培养初期加入细胞分裂抑制剂（如,5-,氨基尿嘧啶），一旦去除抑制剂后细胞可以同步发育。,（,2,）低温法：低温处理抑制细胞分裂，再恢复正常温度可以使细胞分裂同步化。,（,3,）渗透压法：不同发育时期的胚状体对渗透压的要求不同，用一定的渗透压使胚状体停止在某一阶段，然后再使其同步发育。,（,4,）通气法：细胞分裂旺盛时有大量气体（如乙烯等）生成。可以通过在培养基中通入乙烯或氮气控制细胞同步分裂。,（,5,）分离筛选法：用不同孔径的筛网将不同发育时期的胚状体分离开来，也可以采用密度梯度离心法来选择不同发育期的胚状体。,2,、人工种皮制作,理想的人工种皮应该具有保护胚状体的功能，并且具有无毒、良好的通气性、抗污染、适合运输等特点。,最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有定毒性、易溶解于水等不足。,目前采用海藻酸盐较多，其具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性低、成本低廉等优点。但是也存在一些缺点，如水性营养成分易流失表面易结团等。,因此开发开发理想的人工种皮材料仍是一个重要课题。,3,、人工胚乳配制,人工胚乳主要包括无机盐、碳水化合物、蛋白质等（培养基组分）。,人工胚乳是胚胎发育的营养保证。,由于糖等物质的存在易导致微生物污染，所以要加入防腐剂、抗菌素、农药等成分。,4,、包埋,包埋是人工种子制作的重要一环。,方法主要有以下两种下两种：,（,1,）干燥法：早期较古老的方法，将胚状体置于,23,、,70%,左右相对湿度、黑暗条件下逐渐干燥，然后用聚氧乙烯等种皮材料包裹。,（,2,）水凝胶法：目前比较常用的一种方法，用海藻酸钠等水溶性凝胶与氯化钙进行离子交换后凝固的特点包埋单个胚状体或芽。,种子硬度由凝胶浓度与络合时间控制。,将成熟的体细胞胚胎与包被液相混合，然后将其滴入（只允许一个通过）适当浓度的氯化钙溶液中，经过络合作用（生成海藻酸钙）的造形过程，在,20-30,分钟内形成内含细胞胚并有一定硬度的雏形人工种子。,1,、人工种皮性能不尽人意。,2,、还没有一种符合多数植物胚状体需要的人工胚乳工胚乳。,3,、胚状体储藏阶段的休眠控制；,4,、如何保证长期储藏而又不影响萌发率；,5,、制作流程较繁琐、成本高。,6,、许多植物还不能成功地诱导出高质量体细胞胚胞胚。,存在的问题,1,植物组织培养的过程可以归纳为：,。对此叙述有错误的是,(,),A,的再分化过程中，当细胞分裂素与生长素的浓度比低时，有利于根的生成,B,植物组织培养所依据的原理是植物细胞的全能性,C,过程包含了器官再生途径和体细胞胚再生途径,D,包裹上人造种皮可获得人工种子,2,下列有关植物体细胞杂交的叙述，不正确的是,(,),A,用酶解法去掉细胞壁，分离出有活力的原生质体,B,诱导两种植物的原生质体融合，进而形成杂种细胞,C,植物体细胞杂交的最终目的是获得细胞代谢产物,D,植物体细胞杂交技术可以克服不同种间远缘杂交不亲和的障碍,3.,下列属于组织培养的是,(),A,花粉培育成单倍体植株,B,芽发育成枝条,C,根尖分生区发育成成熟区,D,未受精的卵细胞发育成个体,7.,下面关于植物细胞工程的叙述，正确的是,(,多选,)(),A,叶肉细胞脱分化后可形成具有分裂能力的薄壁细胞,B,叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织,C,融合植物叶肉细胞时，应先去掉细胞膜,D,叶肉细胞离体培养时，可以表现出全能性,第三节 植物胚胎培养,植物胚胎培养（,Embryo Culture,）概念：,指对植物的胚、子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植物的技术。,植物胚胎培养,包括：,1,、胚培养（成熟胚培养、幼胚培养）,2,、胚珠培养,3,、子房培养,4,、胚乳培养,5,、离体受精等,胚,胚芽,胚轴,胚根,子叶,种子,胚珠,胚培养：,指在无菌条件下将胚从胚珠或种子中分离出来，置于培养基上进行培养的技术。,胚的发育过程包括从,合子分裂,到,幼胚形成,直至发育为,成熟胚,的过程。,植物胚胎发生过程：,原胚,球形胚,心型胚,鱼雷胚,子叶胚,成熟胚,球形胚前期,球形胚,心型胚前期,鱼雷胚,1,、胚培养,球形胚前期,球形胚,心型胚,鱼雷胚,成熟胚,成熟胚培养,(mature embryo),幼胚培养,(immature embryo),子叶形成之前,子叶形成之后,胚培养类型,（,1,）成熟胚培养：,指子叶期至发育成熟的胚培养。成熟胚是自养的，培养基需要简单。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育。,培养过程：,种子,95%,酒精消毒,选取完好种子,70%,酒精浸数秒,0.1%,升汞或,10%,次氯酸钠浸泡,无菌水冲洗,种子培养几天,剥离种胚,接种在培养基上。,台湾红豆杉成熟胚培养,牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖,（,2,）幼胚培养：,幼胚是指处于原胚期、球形期、心形期、鱼雷期的胚培养；幼胚完全是异养的，离体条件下培养要求培养基成分复杂，培养不易成功。,幼胚培养的生长发育方式：,胚性发育：胚只是在体积上增大甚至超过正常胚大小而不能萌发成苗。,早熟萌发：幼胚不再发育，迅速萌发成幼苗。多数情况一个幼胚萌发成一个植株，有时因细胞分裂形成许多胚状体，进而形成许多植株，即丛生胚现象。,愈伤组织：多数植物幼胚形成愈伤组织。再分化成胚状体或形成芽苗。,影响幼胚培养的因素：,A,、天然提取物及某些蛋白制品；,1934,年银杏幼胚培养中添加银杏胚乳有促进作用；,1941,年曼佗罗幼胚培养中发现添加椰子乳能很好的促进幼胚的发育,(200-500um,的幼胚,),。,此外，大麦胚乳、麦芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促进幼胚的发育。,B,、渗透压的作用：,胚发育早期要求较高的的渗透压，而随着胚的发育逐渐降低。,C,、植物激素及生长调节剂的作用：,加入适当浓度的生长素、细胞分裂素 可以促进胚的发育，单一激素影响发育。,D,、其他因素：,pH,值以,54-5.8,适宜多数幼胚。,温度,25-30,o,C,适宜多数植物。,2,、胚珠培养及子房培养：,胚珠培养包括授粉胚珠和未授粉胚珠的培养。,1942,年最早在兰花上获得成功，缩短了授粉到成熟的时间。,1980,年成功培养了未授粉的非洲菊、烟草的胚珠，获得了单倍体植株。,胚珠培养：,将胚珠从母株中分离出来，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以致形成幼苗的过程。,根据胚珠是否受精分为两类：,未受精胚珠的培养,受精胚珠的培养,胚珠培养技术,大孢子或卵,单倍体植株,种子,愈伤组织,再生植株,胚珠培养的方法,子房,表面灭菌,剖开子房壁,取出胚珠,接种培养,如培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房；,如培养未受精胚珠，则在授粉前摘取子房,胚珠或带胚珠的胎座,将子房从母株上摘下，放在无菌的人工环境条件下，让其进一步生长发育，以至形成幼苗的过程。,子房培养包括,授粉子房,和,未授粉子房,培养。,1949,年和,1951,年最早在黄瓜、番茄、菜豆、草莓、烟草等植物上获得成功。,授粉子房培养形成成熟果实和种子；,未授粉子房培养形成小的无籽果实。,受精后的子房仍需进行表面消毒后再接种。而未受精子房可将花被表面消毒后，在无菌条件下直接剥取子房接种。,子房培养只需较简单的培养基即可形成果实，并含成熟种子。,子房培养技术,子房培养的方法,授粉或授粉后的子房,表面消毒,接种培养,影响胚珠培养的因素：1,）材料选择：,品种间的差异、胚囊发育时期,（,2,）材料的消毒：,污染、消毒剂,（,3,）培养基：,A.,植物激素,授粉胚珠：细胞分裂素对胚发育通常有促进作用。,未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牵牛未授粉胚珠培养不需激素，其他需要适当添加。,B.,有机物：,添加有机附加物可以促进授粉胚珠的发育。,C.,蔗糖浓度：,3-12%,，通常,5%,，高浓度利于孤雌生殖。,（,4,）胎座组织的影响：,促进胚的发育。,3,、胚乳培养,胚乳培养：,是指将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。,被子植物胚乳是由,2,个单倍的极核和,1,个单倍的精子结合而成的,3,倍体组织,。由它可获得无子结实的,3,倍体植株，进而可将它加倍成,6,倍体植株。,裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳为配子体的一部分，由大孢子直接分裂发育而成，因此是,单倍体组织,。,胚乳培养过程,含胚乳的果实或种子,表面消毒,无菌条件下胚乳的剥离,接种培养基培养,培养室温度,25-27,，黑暗或弱光下,胚乳培养应注意的问题：,（,1,）确定适宜的发育时期（生长旺盛期）；,（,2,）严格区分胚乳和其他组织；,（,3,）合理使用激素；,（,4,）注意光、温条件（,24-28,0,C,；黑暗条件）。,离体授粉技术：,将未授粉的离体胚珠或子房接种在培养上，然后在试管内撒播花粉。在离体的、受人工控制的环境下，通过技术操作来完成植物雌雄配子体的融合。受精后的胚珠进一步发育成种子。,根据授粉的部位可分为：,（,1,）离体柱头授粉：,（,2,）离体子房授粉：,（,3,）离体胚珠授粉：,离体受精技术：,在离体条件下完成被子植物精、卵融合，并将受精所所生的“人工合子”培养成再生植株。,离体受精技术的突破的技术前提：,（,1,）雌配子和雄配子分离技术,（,2,）单对原生质体,(,精卵,),融合技术,（,3,）微培养技术,(,合子培养与植株再生技术,),4,、离体授粉与离体受精,培养,部位,意义,类型,外植体选取,取材时间,培养方法,胚珠,1.,克服杂种胚败育,2.,进行试管受精,3.,用于单倍体育种,1.,受精胚珠培养,2.,未受精胚珠培养,选取合适子房，表面消毒后取出胚珠,球形胚,长大形成种子，继而形成幼苗,子房,1.,诱导单倍体植株,2.,进行试管受精,3.,获得杂种植株,1.,受精子房培养,2.,未受精子房培养,选取合适子房，表面消毒后直接接种,开花前,1,5d,形成果实或形成胚状体、愈伤组织,胚乳,1.,获得三倍体植株,2.,不同倍性胚乳植株,1.,核型胚乳培养,2.,细胞型胚乳培养,幼嫩果实表面消毒后取出种子，分离出胚乳,授粉后,4,8d,诱导形成愈伤组织，然后分化形成胚状体或器官,胚珠、子房和胚乳培养的对比,1,、植物胚胎培养分为哪些类型？各有何特点和要求？,2,、胚胎培养有何重要意义？,3,、在进行幼胚培养时，由于幼胚过小而分离困难，可采取什么途径？,4,、为什么幼胚比成熟胚培养要求的培养基成分复杂？,5,、在植物组织培养中，通过哪些途径可以得到完整的植株？,思考题,第四节 脱毒植物培养,植物组织中病毒的分布,病毒在植物组织中,分布不均匀,：在顶端分生组织中含毒少，在老组织中病毒增加。,（茎尖培养脱毒的理论依据）,植物茎尖分生组织无病毒原理（原因）：,(1),能量竞争：病毒核酸和植物细胞分裂时,DNA,合成均需要消耗大量的能量，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来自我复制，因而就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。,(2),传导抑制：病毒在植物体内的传播主要是通过维管束实现的，但在茎尖分生组织中，维管组织还不健全或不存在，从而抑制了病毒向分生组织的传导。,(3),激素抑制：在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因而阻滞了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。,(4),酶缺乏：病毒的合成需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制。,(5),抑制因子：在分生组织中存在有某种抑制因子，如 “酶钝化系统”。,常用的植物脱毒方法,生物方法：,1.,茎尖培养法：,目前最常用的脱毒方法，其机理是病原体在植物体内的分布是不均匀的，越靠近生长点，病毒浓度越低。,2.,愈伤组织培养法：,通过无毒的愈伤组织培养可以获得无毒植株。,珠心组织培养法：,通过无毒的,珠心,组织培养可以获得无毒植株。,物理方法,1.,热处理法：,传统的消毒方法，其基本原理是植物细胞比病毒耐高温。用,37,温度热处理植物材料，在不损伤培养材料的前提下，抑制病毒的复制，钝化病毒的活性。,2.,低温冷冻法,化学方法,嘌呤、嘧啶类似物，氨基酸，抗生素等处理患病植物，从而抑制植物体内病毒的复制。,一、茎尖培养脱毒,1,、根据培养目的和取材大小可将茎尖培养分为,:,1,）普通茎尖（,Shoot tip,）培养。,较大茎尖（几毫米至几十毫米的茎尖）培养技术。技术简单，操作方便，茎尖易成活，成苗所需时间短，能加速繁殖速度。,2,）茎尖分生组织,(apical meristem),培养,。,仅限于幼龄叶原基顶端圆锥区，其直径和长度大约,100,250m,，即,小于,0.3mm,的茎尖,为茎尖分生组织。,马铃薯茎尖分生组织培养,2,、在茎尖培养中影响脱毒的因素,1,）培养基：,营养成分：,MS,培养基，,K,+,NH,4+,含量,生长调节剂：少量的生长素（,NAA,IAA),、细胞分裂素（,6-BA,）、,GA,3,2,）外植体的大小：,决定存活率的大小,三个因素,：根除病毒、可以发育为完整植株的能力、带有叶原基。,3,）培养条件,：,光照,4000lx,（照光比暗培养效果好，但对于易褐化的材料需一段暗培养）,温度,：,252,（低温会使茎尖休眠，不利于萌发）。,4,）外植体的生理状态,：,顶芽茎尖比腋芽茎尖效果好。,生长期的材料比,休眠,期好。,二、愈伤组织脱毒,研究表明，在愈伤组织培养过程中，随着愈伤组织的迅速增生，病毒感染的程度会明显降低。,经过多次继代培养，新产生的愈伤组织的分散程度增加，染病的几率会越来越小，从愈伤组织诱导生产的试管苗，就会得到脱毒的再生植株。,原因：,细胞的增殖速度快于病毒复制的速度；,细胞产生变异，获得对病毒感染的抗性，最终表现出脱毒现象。,三、珠心胚培养脱毒,珠心组织与维管束没有联系，故可以培养珠心组织得到无病毒植株。,如柑橘类多胚品种中,除一个受精胚外，尚有多个有珠心细胞形成的无性胚，,称为,珠心胚,。,珠心胚与维管束系统无联系，因此由此产生的植株全部为无病毒的植株。,四、热处理脱毒,热处理（,heat treatment,）,与茎尖培养结合，即可取较大的茎尖培养，大大提高茎尖成活率和增殖率，又达到消除病毒的目的。印度尼西亚的爪哇人（,1889,），甘蔗的枯萎病，在,50-52,热水中，,30min,，即可使甘蔗生长良好，达到脱除枯萎病的作用。,1,、方法：,热水,:,休眠芽（,50,热水浸渍数分钟,数小时）,热气,:,活跃的茎尖。温度,35-50,，处理时间长度各异。,（处理时间长短可根据病毒浓度、寄主蛋白含量、温度高低来确定）,如：香石竹：,38,，,2,个月；,马铃薯,(X,