第2讲-植物的人工繁殖.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,2,讲 植物的人工繁殖,上节课回顾,两个思考题,1.,什么是细胞工程？,2.,细胞工程包含哪几个主要研究内容,例子,1,：兰花组织培养,名贵兰花,达摩兰：以,禅宗“一花开五叶，结果,自然成”的诗意命名。,在台湾，早期达摩兰量少，,求种者多，非常昂贵；有,人曾以一盆爪艺达摩交换,台中市一栋高楼。,兰花是第一个组织培养成,功,产业化,的植物。珍稀而,名贵的达摩兰等名贵兰花，,如今已成市井之花。一株,不过百元。,例子,2,：土豆：,第二面包,，,植物之王”，热量低于谷,类粮食，是理想的减肥食物，和玉米、小麦、水稻、,燕麦被称为世界五大粮食作物。,欣赏一个视频：脱毒植物的培育,gene,）,：又称组织特异性基,因（,Tissue-specific gene,），是在各种组织中进,行不同的,选择性表达,的基因，与各类细胞的特殊,性有直接关系。,持家基因（,House-keeping gene,）,：是维持细胞,的,基本结构和最低限度功能,所不可少的基因，例,如：编码组蛋白、核糖体蛋白、线粒体蛋白、糖,酵解酶等基因。这类基因在所有类型的细胞中都,表达。,5.,脱分化（,Dedifferentiation,）,：又称去分,化，是指分化细胞失去特有的结构和功能,变为,具有未分化细胞特性,的过程，即分化,的细胞,在适当条件下,转变为,胚性状态,而重,新获得,分裂能力,的过程。,脱分化后的植物细胞经过细胞分裂，产生,无组织结构、无明显极性的松散的细胞团,，称之为,愈伤组织（,Callus,）,。,需要采用人工诱导技术诱导体细胞的脱分,化。不同生物的细胞脱分化能力不同，决,定了组织培养再生的难易。,植物人工繁殖技术,目地：,为克服自然,有性生殖,的不足，满足对优,良植物的大量需求,手段：,通过,无性繁殖,技术实现植物快速繁殖,。,植物人工繁殖的方法：,组织培养、人工种子、胚胎培养等,一、植物组织培养再生植物,植物组织培养（,Plant tissue culture,）,是将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成,完整植株,的一种技术。,思考题：,为什么植物组织培养能实现植物大规模繁殖？与传统繁殖途径的优点在哪里？,（一）植物组织培养的,优点,1.,周期短，便于人工控制培养条,件。繁殖速度快，经济效益高。,2.,占用空间小，不受地区、季节,限制。,3.,繁殖珍稀、濒危苗木和突变体,，是优良品种培育的有效途径。,4.,利于保持原来品种的特性。,（二）植物组织培养的,应用,1.,无性系快速繁殖：,例如一株兰花一年可以繁殖到,400,万株。,2.,种苗脱毒：,可以有效地培育出大量的无病毒种苗。已经取得成功的有马铃薯、草莓、香蕉等。,3.,新品种选育,（,1,）利用培养变异，筛选优良 突变体。,植物离体培养，能够明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，培育新品种。,（,2,）利用远缘杂交,幼胚培养,，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。,有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。,（,3,）利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。,野生种往往有许多优良性状，如抗干旱、抗病虫害、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱、抗冻等特性。但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。,（,4,）倍性育种,4.,离体种质保存,随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用,组织培养法,，低温保存（,-196,）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。,5.,在遗传、生理生化和病理等研究上的应用。,如光合作用、植物营养问题、植物抗病性等等。,（三）植物组织培养,技术,1.,生物条件,外植体（,Explant,）,主要指用于离体培养的植物或组织切段。,因素：,不同植物品种,同一品种不同取材部位、发育阶段。,一般：生长点、幼嫩组织,2.,物理条件,：培养环境、,组织培养室,无菌环境人工控制温度、,光照、湿度等培养条件。,需要一定的设备、器材和,用具。,3.,化学条件：,培养基,（,1,）无机盐,培养基中无机盐的浓度通常在,25mmol/L,左右。,根据添加量多少分为大量元素（浓度大于,0.5mmol/L,）和微量元素,(,浓度低于,0.5mmol/L),。,大量元素：,主要有氮、硫、磷、钾、钙、镁。氮、硫、磷是蛋白质、氨基酸、核酸和酶的主要成分。,微量元素：,主要包括铁、锰、铜、锌、氯、硼、钼等。这些微量元素对于蛋白或酶的生物活性十分重要，并参与生物过程的调节,（,2,）有机物,常用的有机物：糖类、氨基酸、维生素、醇类等。,糖类：,是离体培养的植物细胞所必需的，既可以作为碳源，又可以维持,渗透压,。最常用的碳源是,蔗糖,，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。蔗糖使用浓度在,2%3%,。,氨基酸：,是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用的氨基酸是,甘氨酸,，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用,蛋白质水解产物,（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。,维生素：,以各种,辅酶,的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。虽然大多数的植物细胞在培养中都能合成所必需的维生素，但在数量上不足，通常需加入一至数种维生素。常用的维生素包括：盐酸硫胺素（,Thiamine,VB1,）、盐酸吡哆醇,Pyridoxin,VB6,）、,Vc,（抗坏血酸）、有时还使用生物素、叶酸、,VB12,等。,VB1,对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，,VB6,能促进根的生长。,Vc,有防止组织变褐的作用。,肌醇：,对糖类的相互转化有促进作用。能促进愈伤组织的生长以及,胚状体和芽,的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。,腺嘌呤：,是合成细胞分裂素的前体物质之一。添加腺嘌呤能促进细胞,合成分裂素,，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成。,植物激素,(Phytohormone),：,是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的,微量有机物。能影响生长和分化,。,在个体发育中，不论是种子发芽、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程，,主要由激素控制。,植物体内的激素与细胞内某种称为,激素受体,的蛋白质结合后，,影响,DNA,、,RNA,和蛋白质的合成，并对特殊酶的合成起调控作用，从而表现出调节代谢的功能。,生长素,(auxin),生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的。,在植物组织培养中，,生长素主要用来刺激细胞分,裂和诱导根的分化。,常用的生长素有：吲哚乙酸（,IAA,）、,2,，,4-,二氯苯氧乙酸（,2,，,4-D,）、萘乙酸（,NAA,）、吲哚丁酸（,IBA,）等。,IAA,活力较弱。,NAA,起动能力要比,IAA,高出,3-4,倍。,IBA,是促进发根能力较强的生长调节物质。,NAA,和,IBA,广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。,2,，,4-D,起动能力比,IAA,高,10,倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成。,细胞分裂素（,Cytokinin,）,细胞分裂素大多是,嘌呤族衍生物,，自然状态下分裂素主要在根中形成，茎端、萌发中的种子、发育中的果实和种子也能合成分裂素。,分裂素的生理作用,主要是诱导芽的分化促进侧芽萌发生长、促进细胞分裂与扩大,。,多用于,诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,，而在生根培养时使用较少或用量较低。,主要有激动素（,KT,）、,6-,苄基腺嘌呤（,BA,）和玉米素（,ZT,）等。其中最常用的是,6-,苄基腺嘌呤。,激素配比,（,4,）培养基及分类,几种常用的培养基,组分,MS,B,5,SH,N,6,大量元素,mg/L,mmol/L,mg/L,mmol/L,mg/L,mmol/L,mg/L,mmol/L,NH,4,NO,3,KNO,3,CaCl,2,2H,2,O,MgSO,4,7H,2,O,KH,2,PO,4,NaH,2,PO,4,H,2,O,(NH,4,),2,SO,4,KCl,1650,1900,440,370,170,20,6,18,8,3,0,1.5,1.25,2500,150,250,150,134,25,0,0,11,2.0,2500,200,400,125,750,25,4,6,9,19.0,2830,166,185,400,463,28,1,75,2.94,6.6,微量元素,mg/L,mol/L,mg/L,mol/L,mg/L,mol/L,mg/L,mol/L,KI,H,2,BO,3,MnSO,4,H,2,O,ZnSO,4,7H,2,O,NaMoO,4,7H,2,O,CuSO,4,5H,2,O,CoCl,2,6H,2,O,FeSO,4,7H,2,O,Na,2,-EDTA,0.83,6,2,15.6,8,6,0.25,0.025,0.025,27.8,37,3,5.0,100,92.5,30,1.00,1,100,100,75,3.0,10,2.0,25,0.025,0.025,27.8,37.3,4.5,50,60,7.0,0,1,0.1,100,100,0,5.0,10,1.0,0.25,0.02,15,20,6.0,80,60,3.5,1.0,0.8,55,55,0.8,1.6,3.3,1.5,27.8,37.3,4.8,26,19.5,5.2,100,100,蔗糖（,g/L,）,30,20,30,50,pH,值,5,7,5.5,5.8,5.8,培养基的配制,培养基母液的配制,大量元素母液：,即是含有,N,、,P,、,S,、,K,、,Ca,、,Mg,、,Na,等大量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量较高，一般配制成,10,倍浓度的母液。在使用时，每配制成,1000mL,培养液，吸取,100mL,母液。在配制母液时，要先将各个组分单独溶解，然后按照一定的顺序一边搅拌，一边混合，特别要注意,将钙离子（,Ca,+,）与硫酸根、磷酸根离子错开,，以免生成硫酸钙或磷酸钙沉淀。,微量元素母液：,即含有,B,、,Mn,、,Zn,、,Co,、,Cu,、,Mo,、,I,等微量元素的无机盐混合液。由于各组分的含量低，一般配制成,100,倍浓度的母液。在使用时，每配制,1000mL,培养液，吸取,10mL,母液。,铁盐母液：,由于铁离子与其他无机元素混在一起放置时，容易生成沉淀，所以铁盐必须单独配制成铁盐母液。铁盐一般采用,螯合铁（,Fe-EDTA,）,。通常配制成,100,倍（或者,200,倍）浓度的铁盐母液，在使用时，每配制,1000mL,培养液，吸取,10mL,（或者,5mL,）铁盐母液。,维生素母液：,是各种维生素和某些氨基酸的,混合液,。一般配制成,100,倍浓度的母液。在使用时，每配制,1000mL,培养液，吸取,10mL,母液。,植物激素母液：,各种植物激素,单独配制成母液,。一般浓度为,100mg/L,。使用时根据需要取用。由于大多数植物激素难溶于水，需要先溶于有机溶剂或者酸、碱溶液中，再加水定容到一定的浓度。它们的配制方法如下：,2,4-D(2,4-,二氯苯氧乙酸,),母液：,称取,2,4-D 10mg,，加入,2mL 95%,乙醇，稍加热使之完全溶解，（或者用,2mL 1mol/L,的,NaOH,溶解后）加蒸馏水定容至,100mL,。,IAA,（吲哚乙酸）母液：,称取,IAA 10mg,，溶于,2mL 95%,乙醇中，再用蒸馏水定容至,100mL,。,IBA,（吲哚丁酸），,GA,（赤霉酸）母液的配制方法与此相同。,NAA,（萘乙酸）母液：,称取,NAA 10mg,，用,2mL,热水溶解后，定容至,100mL,。,KT,（激动素）母液：,称取,KT 10mg,，溶于,2mL 1mol/L,的,HCl,中，用蒸馏水定容至,100mL,。,BA,（苄基腺嘌呤）母液的配制方法与此相同。,玉米素母液：,称取玉米素,10mg,，溶于,2mL 95%,的乙醇中，再加热水定容至,100mL,。,4,、植物组织培养的基本步骤,（,1,）培养材料的采集,植物具有全能性的细胞：受精卵；发育中的分生组织细胞；雌雄配子及单倍体细胞。,用哪一部分器官最适于作为组培的材料来源,:,器官的生理状态和年龄；取材季节、离体材料的大小、取得离体材料的植株质量等。,快速繁殖：常用茎尖（长度,0.5cm,）；,脱毒苗：茎尖分生组织（长度小于,0.1mm,）；,（,2,）培养材料的消毒,先将材料用自来水洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。,在无菌环境中将材料放入,70%,的酒精,中浸泡,30-60s,。,再将材料移入,漂白粉饱和液,或,0.1%,升汞,中消毒。,无菌水冲洗,34,次,。,常用的消毒剂：,下表列出了目前常用的灭菌消毒剂。其使用浓度和处理时间，应根据外植体的情况及其对灭菌剂的敏感性而定。,消毒剂,使用浓度（,%,）,去除消毒剂难易,消毒时间（,min,）,灭菌效果,次氯酸钠,次氯酸钙,漂白粉,升汞,酒精,过氧化氢,溴水,硝酸银,抗生素,2,510,饱和溶液,0.11,7075,1012,12,1,450mg/L,易,易,易,较难,易,最易,易,较难,中,530,530,530,210,0.22,515,210,530,3060,很好,很好,很好,最好,好,好,很好,好,较好,（,3,）制备外植体,接种时外植体的大小和形状取决于实验目的（茎、叶、根、花、果实、种子或其中某种组织切块,0.5cm,，茎尖、胚、胚乳按组织单位切离）,（,4,）接种和培养,接种,封口,温度和光照,增殖：,新梢,形成后，继代，把新梢分株或切段转入增殖培养基中进行增殖。,（,5,）根的诱导,生根是获得完整植株的一个关键,。,通过腋芽、不定芽、愈伤组织途径产生的芽长成试管苗，必须诱导生根才能移植,。,促使试管苗生根的方法通常有两种：,1,、,在固体培养基上诱导生根,:,当试管苗长到,2,3,厘米高时，将它从基部切下转移到固体培养基上生根（生根培养基一般要求,降低矿物营养的浓度，提高生长素的浓度,，具体应根据植物不同而定）。,2,、浸泡的方法,:,将切下的无根试管苗泡在含有高浓度生长素溶液中，生长素浓度为,100,毫克,/,升左右，浸泡时间从几小时到,1,天，然后取出接种于不加任何激素的,MS,培养基上或者扦插在人工基质上，十天左右即可生根。,（,6,）炼苗和移栽,试管苗的生长环境无菌 异养 弱光 恒温,芦荟的植物组织培养过程,1 2 3 4 5,6 7 8 9,10 11,5,、植物组织培养再生植株的途径,以胡萝卜为例,器官发生途径,体细胞胚发生途径,体细胞胚（,Somatic embryo,）,又叫胚状体，是指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的,胚胎类似物。,体细胞胚发生途径：,是指体细胞在离体培养过程中经过了胚胎发育过程。体细胞胚起源于,非合子细胞,，因此不同于合子胚。,（,1,）器官外植体直接发生途径,体细胞胚胎发生途径,1,：,叶片,诱导阶段,胚胎发育阶段,(,兰草,Chen,等,1999),兰草,体细胞胚胎发生途径,2,：,愈伤组织,诱导愈伤组织形成,愈伤组织胚性化,球形胚形成,子叶胚期,蝴蝶兰,Lin,等,2000,体细胞胚胎发生途径,3,：,悬浮细胞,愈伤组织,胚性愈伤组织,悬浮培养的胚性细胞团,球形胚形成,成熟子叶胚,5.,植物组织培养的问题分析,参考：,（,4,）品种限制,植物组织培养参考图片,人工胚乳,2.,人工种子的优点,3.,关键技术问题,（,2,）人工种皮制作,（,3,）人工胚乳配制,（,4,）包埋,海藻酸钠包埋示意图,（,5,）贮藏与发芽,4.,存在的问题,物 种,主 要 结 果,胡萝卜,(,Daucus carota,),有菌土壤中发芽成苗,苜蓿,(,Medicago sativas,),有菌条件下发芽成苗,芹菜,(,Apium graveolens,),有菌条件下发芽成苗,柑橘,(,C.sinensisC.reticulata,),无菌条件下发芽成苗,挪威云杉,(,Picea abies,),无菌及有菌条件下发芽,松树,(,Pinus lambertiana,P.aeda,),无菌及有菌条件下发芽,玉米,(,Zea mays,),无菌条件下发芽成苗,杂交水稻,(,O.sativaO.lalifolia,),无菌条件下发芽,橡胶树,(,Hevea brasiliensis,),无菌条件下发芽,西洋参,(,Panax quinquefolium,),无菌条件下发芽,刺五加,(,Acanthopanax senticosus,),无菌及有菌条件下成苗,黄连,(,Coptis chinensis,),无菌及有菌条件下成苗,表,以体细胞胚为繁殖体的人工种子,物 种,繁殖体,主 要 结 果,印度桑,(,Morus indica,),芽,无菌条件下发芽成苗,檀香,(,Santalum ablum,),芽,无菌条件下发芽成苗,花叶芋,(,Caladium bicolor,),芽,无菌条件下发芽成苗,百合,(,Lilium,),小鳞茎,无菌条件下发芽成苗,直杆桉树,(,Eucalyptus maideni,),侧芽,无菌条件下发芽成苗,莴苣,(,Lacyuca sativa,),芽,无菌及有菌条件下发芽成苗,华腺萼木,(,Mycetia sienensis,),微芽,有菌土壤中发芽成苗,大花蕙兰,(,Cytobium,),原球茎,无菌条件下发芽,石槲兰,(,Dendrobium,),原球茎,无菌条件下发芽,唐菖蒲,(,Gladiolus hortalans,),球茎,无菌条件下发芽,香蕉,(,Musa acuminata,),微芽,无菌条件下发芽,杨树,(,Populus beijingy,),芽,无菌条件下发芽,表,以器官为繁殖体的人工种子,人工种子长出的芹菜味道非常鲜美,西洋参,檀香,