第三章-重要生物制药制造工艺2.ppt

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4.5”,W:5.25”Position:,H:4.5”,V:0,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 生化药物制造工艺,生物工程教研室,刘静霆,1,氨基酸类药物,2,多肽与蛋白质类药物,3,核酸类药物,4,酶类药物,5,糖类药物,6,脂类药物,2 多肽与蛋白质类药物,2 多肽与蛋白质类药物,一、多肽与蛋白质药物概述,二、多肽与蛋白质药物的生产方法,三、重要多肽与蛋白质类药物制备,研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系，将有助于设计和研制新的活性多肽药物,多肽类细胞生长调节因子,表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。,含有多肽成分的其它生化药物,骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉 提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。,多肽类药物分类,蛋白质激素,垂体Pr激素,生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。,促性腺激素,人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。,胰岛素及其他Pr激素,胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。,血浆蛋白质,白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veils病免疫球蛋白，抗D免疫球蛋白，抗HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子。,蛋白质类药物分类,蛋白质类细胞,生长调节因子,干扰素、（IFN）,白细胞介素（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。,粘蛋白,胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。,胶原蛋白,明胶、阿胶等,碱性蛋白质,硫酸鱼精蛋白,蛋白酶抑制剂,胰蛋白酶抑制剂,凝集素,PHA、ConA,蛋白质类药物分类,二、多肽与蛋白质类药物的生产方法,提取分离纯化法,化学合成法,利用基因工程,制备过程：,生物材料的选取与破碎,有效成分的提取,有效成分的分离纯化,原料选择,上 清,破碎 提取,沉 淀,变性 复性,蛋白质纯化,蛋白质药物,Separation and Purification,纯度 活性鉴定,合格,不合格,精品,发 酵,生物组织,Protein-Separation,1、原料选择,2、提取,2 多肽与蛋白质类药物,在目的物提取时,应考虑的方面,：,溶剂的选择,离子强度,pH,温度,稳定性,提取时间,2 多肽与蛋白质类药物,3、分离纯化,（1）蛋白质的,粗分离,-分辨率低,盐析、等电点沉淀、有机溶剂分级分离,（2）蛋白质的,精制分离,柱色谱法、密度梯度离心法、电泳法、亲和层析法,Protein-Purification,1）pI,2）分子形状和大小,3）溶解度,4）电离性质不同,5）功能专一性,6）疏水基团与相应的载体基团结合,7）在溶剂系统中分配,8）选择性吸附,9）其他特殊性质,4、分离纯化方法的选择,（1）分离纯化的早期使用方法的选择,（2）各种分离纯化方法的使用程序,（3）分离纯化后期的保护性措施,（4）对每一步骤方法的优势进行综合评价,纯化方法选择指南,5.溶液中蛋白质浓度的测定：,常用紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝染色法,6、纯度检查,（1）HPLC或FPLC （2）电泳法,（3）免疫化学法 （4）生物测定法,（5）分光光度法 紫外分光光度法,红外分光光度法,多肽化学合成概述,合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。,合成方法,：（1）液相合成,（2）固相合成,（1963年R.B.Merrifield 创立，并因此获1984年获诺贝尔化学奖）,多肽合成的主要步骤,氨基的保护和羧基的活化,羧基的保护和氨基的活化,接肽和去保护基,1、基团保护,氨基保护基,苄氧羰基强酸脱除,叔丁氧羰基（BOC）三氟乙酸（TFA）脱除,9-芴甲氧羰基（Fmoc）-哌啶-CH,2,Cl,2,或哌啶-DMF 脱除,2.液相合成肽法,阶梯伸长法,-,合成小肽,混合酸酐法,-,常用,DCC,法,(R,1,CO),2,O,活化酯法,H-,Gly,-OME Z-,Leu-Gly-OME,片断缩合法,-,合成大肽,叠氮法,R,2,-NH,2,Z-Leu-OC,6,H,4,NO,2,R,1,-CO-NH-R,2,片断缩合法,-,合成大肽,叠氮法,多肽的固相合成(Fmoc保护法),（1978年改进的方法，避免了强酸处理）,（三）基因工程法,优点：,1.可生产过去难以获得的蛋白和多肽,2.可深入研究活性物质的生理、生化和结构，扩大应用范围；,3.可发现、挖掘更多内源性生理活性物质,4.可改造和去除内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处；,5.可获得新型化合物，扩大药物筛选来源,。,三、重要的多肽与蛋白质类药物的制备,（一）主要多肽类药物的制备,1.胸腺激素,（Thymus hormones）,（1）胸腺素（Thymocln）,结构和性质-胸腺素组分5,生产工艺：,工艺路线,（2）胸腺肽（Thymus peptides）,结构和性质：,生产工艺：,1922,年-从动物胰腺中提取出,胰岛素,，开创了人类胰岛素治疗的历史。,1926,年-,重结晶胰岛素,1930s,-传统中、长效,动物胰岛素,70s,末-,半合成胰岛素,1982,年-采用基因重组技术生产的,人胰岛素,正式上市。,90s,至今-,重组人胰岛素类似物,成功研发上市，包括超短效和长效人胰岛素类似物,胰岛素（insulin）,Frederick Banting,Charles Best,猪胰岛素,牛胰岛素,赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）,门冬胰岛素,（诺和诺德公司、速效Ins）,甘精胰岛素 (安万特公司、长效Ins),人胰岛素（Insulin）,B30,A8 ;A10 ;B30,B28 ;B29,B28,A21 ;B31 ;B32,3D Structure of Insulin,胰,岛素二聚体（dimer）,胰岛素六聚体（hexamer）,Ins的性质,目前临床使用的胰岛素来源,动物胰脏来源,-经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组DNA技术生产胰岛素,-重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素,动物来源的胰岛素,（28种）,药品名称,生产企业,药品名称,生产企业,ILETIN I,LILLY,NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN,NOVO NORDISK INC,ILETIN II,LILLY,PROTAMINE ZINC&ILETIN I(BEEF-PORK),LILLY,INSULIN,NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC AND ILETIN II,LILLY,INSULIN INSULATARD NPH NORDISK,NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC AND ILETIN II(PORK),LILLY,INSULIN NORDISK MIXTARD(PORK),NOVO NORDISK INC,PROTAMINE ZINC INSULIN,BRISTOL MYERS SQUIBB,LENTARD,NOVO NORDISK INC,REGULAR ILETIN II,LILLY,LENTE,NOVO NORDISK INC,REGULAR ILETIN II(PORK),LILLY,LENTE ILETIN II,LILLY,REGULAR PURIFIED PORK INSULIN,NOVO NORDISK INC,LENTE ILETIN II(PORK),LILLY,REGULAR INSULIN,NOVO NORDISK INC,LENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,SEMILENTE,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN I(BEEF-PORK),LILLY,SEMILENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN II,LILLY,ULTRALENTE,NOVO NORDISK INC,NPH ILETIN II(PORK),LILLY,ULTRALENTE INSULIN,NOVO NORDISK INC,NPH INSULIN,NOVO NORDISK INC,VELOSULIN,NOVO NORDISK INC,半合成来源的胰岛素,（5种）,药品名称,生产企业,INSULATARD NPH HUMAN,NOVO NORDISK INC,MIXTARD HUMAN 70/30,BAYER PHARMS,NOVOLIN 70/30,NOVO NORDISK INC,NOVOLIN L,NOVO NORDISK INC,NOVOLIN N,NOVO NORDISK INC,基因重组来源的胰岛素,（27种）,药品名称,生产企业,药品名称,生产企业,APIDRA,SANOFI AVENTIS US,LANTUS,SANOFI AVENTIS US,EXUBERA,PFIZER,LEVEMIR,Novo Nordisk,HUMALOG,LILLY,MIXTARD HUMAN 70/30,BAYER PHARMS,HUMALOG MIX 50/50,LILLY,NOVOLIN 70/30,Novo Nordisk,HUMALOG MIX 75/25,LILLY,NOVOLIN L,NOVO NORDISK INC,HUMALOG PEN,LILLY,NOVOLIN N,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 50/50,LILLY,NOVOLIN R,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30,LILLY,NOVOLIN R（Purified）,NOVO NORDISK INC,HUMULIN 70/30 PEN,LILLY,NOVOLOG,NOVO NORDISK INC,HUMULIN BR,LILLY,NOVOLOG MIX 70/30,NOVO NORDISK INC,HUMULIN L,LILLY,VELOSULIN BR,NOVO NORDISK INC,HUMULIN N,LILLY,VELOSULIN BR HUMAN,NOVO NORDISK INC,HUMULIN R,LILLY,HUMULIN U,LILLY,HUMULIN R PEN,LILLY,通化东宝,1998,年,12,月研制出中国第一支基因重组胰岛素“甘舒霖”,甘舒霖,R-,常规重组人胰岛素注射液,甘舒霖,N-,低精蛋白重组人胰岛素注射液,甘舒霖,30R-30/70,混合重组人胰岛素注射液,（,30%,常规重组人胰岛素和,70%,低精蛋白重组人胰岛素,）,深圳科兴,苏泌啉,-,常规重组人胰岛素注射液,苏泌啉恩,-,低精蛋白重组人胰岛素注射液,徐州万邦,万邦林,-常规重组人胰岛素注射液,万苏林,猪胰岛素制剂,胰岛素国内主要生产厂家,其他,（持有药品注册证）,-南京新天、上海第一生化、武汉生化等,临床用胰岛素分类,普通胰岛素：从动物胰脏中提取,人胰岛素,传统中长效胰岛素,速效胰岛素,速效人胰岛素类似物,长效人胰岛素类似物,非注射胰岛素,传统中长效胰岛素制剂,低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌结晶,例,：,Eli，Humulin N,Novo，Novolin N,胰岛素锌混悬液,缺陷：,作用时间少于,24,小时,作用峰值明显，夜间低血糖危险性高,吸收不稳定,结霜现象，沉淀玻璃瓶壁，丧失活性,速效胰岛素,礼来公司，Humulin 30/70(30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素),Humulin 50/50,诺和诺德，Novolin 30/70,Novolin 50/50,速效胰岛素,起效时间,达峰时间,峰持续时间,作用消除时间,常规皮下Ins:,30-90min,1.5-2.5h,2-4h,6-8h,生理Ins：,0-20min,30-45min,2-3h,3-4h,特点：,起效快，皮下注射后,15min,起效,达峰快，,30,60min,达药效高峰,药效维持,t,短，约,3h,左右（,2,4h,）,B26-30对于Ins结合Ins受体的功能无关，但对Ins形成二聚体的结构特点有关。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降，且与Ins受体结合能力不变的新型,速效,Ins,类似物。,研制机理,已上市药物,：Lispro、Aspart、Apidra,速效胰岛素类似物,Lispro（赖脯Ins）,Aspart（门冬,Ins,）,APIDRA（赖谷,Ins,）,Insulin Detemir,（Levemir ）,诺和诺德公司研制,glargine（Lantus）,安万特公司研制,长效胰岛素类似物,胰岛素肺部吸入制剂-Exubera,辉瑞、安万特以及Nektar 共同研发,于2006.1.27被FDA批准,一种作用快的胰岛素干粉吸入剂,适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征,胰岛素制备工艺,以动物胰脏为原料提取胰岛素,-酸醇提取法,传统胰岛素-猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶,单峰胰岛素-凝胶过滤纯化,单组分胰岛素-凝胶过滤、离子交换纯化,半合成胰岛素,-,以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素,重组DNA技术生产人胰岛素,AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接,逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素,Insulin crystas,酸醇提取法提取动物胰岛素,注意事项,酶促半合成人胰岛素,Ins A链,Ins B链,转化大肠杆菌,发酵,A链,B链,纯化,二硫键,活性胰岛素,AB链合成人胰岛素,质粒,Ins m,R,NA,反转录,Ins cD,NA,转化大肠杆菌,PCR,连接,胰岛素原,活性胰岛素,二硫键,酶切,提取质粒,限制性内切酶酶切,反转录酶法合成人胰岛素,Thank You！,