第21章常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节,分子杂交与印迹技术,核酸分子杂交,(nucleic acid hybridization),在,DNA,复性过程中，如果把不同,DNA,单链分子放在同一溶液中，或把,DNA,与,RNA,放在一起，只要在,DNA,或,RNA,的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链,(,heteroduplex,),。,一、分子杂交与印迹技术的原理,：,分子杂交与印迹技术的原理与应用；末端终止法测定,DNA,序列的原理；,PCR(polymerrase chain reaction),技术原理；酵母双杂交技术的原理与应用；凝胶阻滞实验的原理与应用；染色质免疫沉淀实验的原理与应用；基因诊断与基因治疗。,熟悉：探针、,DNA,点阵、,DNA,芯片、基因文库；转基因技术、基因靶向灭活、转基因动物与克隆动物；基因诊断常用技术；基因治疗的种类。,了解：分子杂交技术的类别与应用；,PCR,技术的发展与类别；,DNA,自动测序技术；,标签蛋白沉淀实验；基因增补的治疗程序；疾病相关基因的功能克隆与定位克隆；,RNA,干扰技术。,用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为,“,探针,”,，探针可以与固定在,NC,膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,（二）探针技术,二、印迹技术的类别及应用,（一）,DNA,印迹,(Southern Blotting),（二）,RNA,印迹,(Northern Blotting),（三）蛋白质的印迹,(Western Blotting),用于基因组,DNA,、重组质粒和噬菌体的分析。,用于,RNA,的定性定量分析。,用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,其他：,斑点印迹,(dot blotting),原位杂交,(in situ hybridization),DNA,点阵,(DNA array),DNA,芯片技术,(DNA chip),三种印迹技术的比较,分子杂交实验,放射自显影照片,第二节,聚合酶链反应,Polymerase Chain Reaction,5,Primer 1,5,Primer 2,Cycle 2,Cycle 1,5,5,5,5,5,5,Template DNA,一、,PCR,技术的工作原理,5,5,5,5,5,5,5,5,A,B,a,b,a,b,Cycle 3,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,25,30,次循环后，模板,DNA,的含量可以扩大,100,万倍以上。,5,5,3,5,待扩增片段,A a,引物互补,B,链,B b,引物互补,A,链,a,引物,b,引物,第一周期：变性、退火、引物延伸,第二周期：变性、退火、引物延伸。因为,b,互补,A,链，,a,互补,B,链，,所以,b,相当于,B,链，,a,相当于,A,链，所以,a,是,b,链引物，,b,是,a,链引物。,b,A,a,B,第三周期：变性、退火、引物延伸,b,b,a,a,b,a,b,a,PCR,原理,模板,DNA,特异性引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,Mg,2+,PCR,体系基本组成成分,PCR,的基本反应步骤,变性,95,C,延伸,72,C,退火,Tm-5,C,引物,Tm,值减,5,利用特异性引物以,cDNA,或基因组,DNA,为模板获得已知目的基因片段,或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的,mRNA,为模板获得目的片段；,利用简并引物从,cDNA,文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段；,利用随机引物从,cDNA,文库或基因组文库中克隆基因。,二、,PCR,技术,的主要用途,（一）目的基因的克隆,利用,PCR,技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。,PCR,技术高度敏感，对模板,DNA,的量要求很低，是,DNA,和,RNA,微量分析的最好方法。,（三）,DNA,和,RNA,的微量分析,（二）基因突变,A,T,，,，,，,，,将,PCR,技术引入,DNA,序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；,待测,DNA,片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。,PCR,与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。,（四）,DNA,序列测定,（五）基因突变分析,逆转录,PCR(reverse transcription PCR,，,RT-PCR),是将,RNA,的逆转录反应和,PCR,反应联合应用的一种技术。,RT-PCR,是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的,RNA,进行定性及半定量分析的最有效方法。,（一）逆转录,PCR,技术,三、几种重要的,PCR,衍生技术,原位,PCR(in situ PCR),是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的,PCR,反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测,DNA,或,RNA,是否在该组织或细胞中存在。,原位,PCR,方法弥补了,PCR,技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相一种最佳方法。,（二）原位,PCR,技术,人染色体,8q241,显微切割的,PCR,产物的,原位杂交图,（三）实时,PCR,技术,1,、概念：实时,PCR(real-time PCR),技术通过动态的方式监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量,PCR,。,所谓实时荧光定量,PCR,技术，是指在,PCR,反应体系中加入含荧光基团的探针引物，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,2,、实时,PCR,技术原理,Q,R,3,3,5,5,上游引物,下游引物,荧光标记引物,R,Q,3,3,5,5,（荧光探针引物）,*实时,PCR,用于基因拷贝数（模板数）分析的原理：,、,Ct,值的定义：（,CyCle Threslold-Ct,值）,每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时,所经历的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长,。,（指对照与测定管，或不同条件下的,PCR,反应）,、,Ct,值与起始模板的关系,研究表明，每种模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，,起始拷贝数,(,模板数越多，,Ct,值越小）,。利用已知起始拷贝数的标准品并可,分别测得,Ct,值,，作出标准曲线，其中,横坐标代表起始模板拷贝数的对数,，,纵坐标代表,Ct,值（或相反）,。因此，只要获得未知样品的,Ct,值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始模板拷贝数。,图示：,模板含量高，,PCR,循环圈数小，模板拷贝多，,Ct,值小,含不同,DNA,拷贝数的样品达到规定的荧光强度域时所需的扩增循环圈数，即,Ct,值。每条曲线代表一种具已知拷贝数的样品。,Ct,值,横坐标：代表起始模板拷贝数的对数,，,纵坐标：,Ct,值,Ct,值,：,每个反应管内扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经历的扩增循环数。此时扩增是呈对数期增长。如图，,起始模板拷贝数,（对数）越小，,Ct,值越大,Log,起始拷贝量与,Ct,呈线性关系，图示，含拷贝数越多的样品，,Ct,值越小。,实时荧光定量,PCR,标准曲线,Log,起始拷贝量与,Ct,呈线性关系，从图可见，含拷贝数越多的样品，,Ct,值越小。,、,Real Time PCR,定量方法：,绝对定量法：,检测待测起始模板数的精确拷贝数，需事先制作标准曲线,相对定量法：,在待测样品的初始模板数（靶序列）相对于参照样品的量的变化。如可作,Ct,值的比较，即比较,CT,法。,如比较原癌基因是否扩增，初始模板数是否增加？,常用制作标准曲线的标准品：最好是含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒，或,cDNA,，还有纯化的,PCR,产物等,标准模板浓度通常选,5,个点，浓度呈递减或递增的梯度变化,总之，,模板,DNA,的量越多，荧光达到规定的阈值时所需的循环次数就越少，即,Ct,值就越小；,Log,模板浓度与,PCR,荧光达到规定的阈值时所需的循环次数,（,Ct,值）,呈线性关系，,通过已知起始拷贝数（浓度）的标准品，可做标准曲线，根据所测得的待测样品的,Ct,值就可通过标准曲线计算出样品（未知样品）中所含的模板量（初始拷贝数）。,第三节,核酸序列分析,Nucleic Acid Sequence Analysis,核酸序列分析的基本原理：,化学裂解法,(Maxam-Gillbert,法,),DNA,链的末端合成终止法,(Sanger,法,),一、,DNA,链末端合成终止法,G,A,T,C,测序反应,电泳,AACGTGGACT,AACGTGGAC,AACGTGGA,AACGTGG,AACGTG,AACGT,AACG,AAC,AA,A,5,3,正极,负极,ddG,ddA,ddT,ddC,链末端合成终止法测定,DNA,序列的原理,1,、可将待测模板制作成仅差,1,个碱基的寡核苷酸片段；,2,、高分辨率的,PAGE,可使仅差,1,个碱基的寡核苷酸片段有不同的泳动速度而分开,。,模板,合成的序列：,5,，,TTACGTCAT,3,AATGCAGTA,G,A,T,C,测序反应,电泳,AACGTGGACT,AACGTGGAC,AACGTGGA,AACGTGG,AACGTG,AACGT,AACG,AAC,AA,A,5,3,负极,正极,ddG,ddA,ddT,ddC,链末端合成终止法测定,DNA,序列的原理,Sanger,双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（,2,3-ddNTP,）作为链终止剂。,2,3-ddNTP,脱氧核糖的,3,位缺少羟基，（而该羟基它可以与下一核苷酸的,5,磷酸形成磷酸二酯键），因而不能与下一个核苷酸缩合，导致多核苷酸链的延伸终止。如果在,DNA,的合成反应中，加入一种少量的,ddNTP,，则多核苷酸链的延伸将在随机的位点终止，生成一系列长短不一的核苷酸链。在每组独立的,DNA,合成反应中，分别加入,1,种,ddNTP,，结果生成的,4,组核苷酸链将分别终止于各个,A,，,G,，,C,，,T,的位置上。对这,4,组核苷酸链进行高分辨变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（高压电泳），就可读出序列。,双脱氧末端终止法测序原理,二、,DNA,自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现,DNA,序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行,Sanger,测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小,DNA,片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定,DNA,碱基的排列顺序。,ddG,ddA,ddT,ddC,红色荧光,绿色荧光,黄色荧光,蓝色荧光,电泳,DNA,序列自动分析原理及结果图,第四节,基因文库,Gene Library,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA library),基因文库,(,gene library),是指一个包含了某一生物体全部,DNA,序列的克隆群体。,一、基因组,DNA,文库,基因组,DNA,文库是指生物的,基因组,DNA,的信息（包括所有的编码区和非编码区）以,DNA,片段形式贮存的克隆群体。,用于构建基因组文库的载体有,噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。,基因组文库和,cDNA,文库的构建和筛选,cDNA,文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部,mRNA,经逆转录而合成的,cDNA,序列,的克隆群体，它以,cDNA,片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。,二、,cDNA,文库,第五节,生物芯片技术,Biological Chip Technique,是指将许多特定的,DNA,片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作,DNA,微阵列,(DNA microarray),。,一、基因芯片,基因芯片,(gene chip),基因芯片工作流程示意图,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应,蛋白质芯片,(protein chip),蛋白质芯片,作用原理,第六节,生物大分子相互作用研究技术,The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study,一、蛋白质相互作用研究技术,酵母双杂交,各种亲和分析（,标签蛋白沉淀,、免疫共沉淀等）,荧光共振能量转换效应分析,噬菌体显示系统筛选,常用蛋白质相互作用的研究技术,标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的、分析蛋白质体外直接相互作用的方法。,（一）标签蛋白沉淀,标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。,标签融合蛋白沉淀实验流程示意图,（二）酵母双杂交技术的基本原理,和用途,酵母活化因子,GAL4,bait,prey,酵母双杂交技术（,THS,、,Y2,）,概念：,是一种用于筛选蛋白质与蛋白质之间相互作用的技术，主要通过将被研究的蛋白质融合到一个转录激活蛋白的两个独立的结构域之间,(,结合结构域与激活结构域）进行操作。,b.1989,年，由,Song,和,Field建立,关于转录激活因子,酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。,其原理是当猎物蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用,。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究,原理,prey,酵母活化因子,GAL4,BD,基因,AD,基因,转录调节因子结构,DNA,结合域,转录激活域,TF,蛋白质,-,蛋白质结合域,（二聚化结构域）,谷氨酰胺富含域,酸性激活域,脯氨酸富含域,酵母双杂交技术的应用,(1,）、检验一对功能已知蛋白间的相互作用。,(2,）、研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。,(3),用已知功能的蛋白基因（诱饵蛋白）筛选双杂交,cDNA,文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。,(4),分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。,电泳迁移率变动测定,(,electrophoretic mobility shift assay,，,EMSA),或称凝胶迁移变动实验,(,gel shift assay),最初用于研究,DNA,结合蛋白与相应,DNA,序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，且已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究,RNA,结合蛋白和特定,RNA,序列间的相互作用。,二、,DNA-,蛋白质相互作用分子分析技术,电泳迁移率变动测定,A,）,DNA to be analyzed,复习题,1,、,PCR,的基本原理？,PCR,反应体系包括哪些组分,?,常用,PCR,有哪些及其应用。,2,、,DNA,测序需用哪些酶与底物？简述,DNA,测序的原理。,3,、简述酵母双杂交原理？钓饵蛋白和猎物蛋白的作用及如何证明蛋白质之间发挥了相互作用。,4,、比较转基因，动物克隆和基因敲除的概念。,染色质免疫沉淀技术,(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP,),是目前可以研究体内,DNA,与蛋白质相互作用的主要方法。,（二）染色质免疫沉淀法,染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图,遗传修饰动物模型的建立及应用,T,he Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model,第七节,转基因技术,采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因,被导入的目的基因,转基因动物,(,transgenic animal),目的基因的受体动物,一、转基因技术,受精卵或着床前的胚胎干细胞,活体组织检查,核转移技术,即,动物整体克隆技术,，,将动物的一个体细胞核全部导入另一个体的去胞核的的激活的卵细胞内，使之发育成个体，即克隆,(clone),。,二、核转移技术,“,多利”的诞生,1997,年,2,月,27,日英国爱丁堡罗斯林,(Roslin),研究所的伊恩,维尔莫特科学研究小组向世界宣布，世界上第一头克隆绵羊“多利”,(Dolly),诞生，这一消息立刻轰动了全世界。,世界上第个克隆羊,多利,中国完成世界首例转基因克隆兔实验,(,图,),左为克隆兔，右为代孕兔。,2007,年,12,月,14,日,09:20:43,来源：科技日报,中国首例异种克隆动物“北山羊”在新疆降生,2004,美国科学家成功,克隆,灵长类,动物,韩国培养出世界上首批克隆狗,（一）、基本概念,基因剔除技术,(,gene knock out,),也称基因靶向,(,gene targeting,),灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,将灭活的基因放入,胚胎干细胞,(embryonic stem cell,，,ES),中，使这一灭活基因通过同源重组取代原有的目的基因，筛选到基因已定点灭活的细胞后，,通过显微注射将细胞注入小鼠囊胚中。,细胞在小鼠囊胚中参与胚胎的发育，最终形成嵌合体小鼠。,操作方式,A,、制备基因敲除的胚胎干细胞（同源重组）,B,、制备基因敲除动物（小鼠）,（二）、基因敲除的原理与程序,A,、制备基因敲除的胚胎干细胞,1,、打靶载体的构建：在一克隆载体上组装包括，待敲除的目的基因（同源臂），用于筛选的 新霉素（,Neo,r,）,基因和胸苷酸激酶基因,(,tk,),。,2,、将构建的打靶载体转入胚胎干细胞，,(,为使靶载体上的新霉素基因能与干细胞内的目标基因发生同源重组而剔除目标基因,),。,3,、,筛选基因敲除的胚胎干细胞,待剔除基因,克隆,克隆载体,重组载体,切割基因使待剔除基因失去活性,阳性标记基因,Neo,r,连接,HSV-tk,打靶载体,褐色大鼠,胚胎干细胞,A,、制备基因敲除的胚胎干细胞,这样打靶载体包含了：,1部分,待剔除的基因片段,，（用于与野生型的该基因进行交换重组）,2,、阳性筛选标志基因（,Neor,，,neomycin-resistance gene),、,使细胞具有抵抗,G418,（能被新霉素抵抗基因的表达产物分解）的能力。,3,、阴性筛选标志基因即,胸苷酸激酶,(thymidine kinase-tk),基因，来自单纯庖疹病毒（,HSV,），当它在受体细胞内合成出,tk,时，可以分解细胞培养液中加入更昔洛韦，即,gangcyclovir,（一种环鸟苷酸底物,),而产生有毒的分解物使细胞死亡，,为阴性筛选标志,。,在特定基因剔除时，利用打靶载体上留下的部分待剔除的基因片段作为基因组上相同基因的同源臂，,当打靶载体与细胞基因组的同源基因发生同源重组时（联会），,打靶载体上的失活基因替代基因组上的基因，同时利用插入在基因同源臂之间的阳性、阴性标志基因进行筛选鉴定。,1,2,3,1,号发生位点同源重组，在,G418,培养基中生长；,2,号为随机插入重组，带入,tk,基因，可在,G418,培养基中生长，但在,gangcyclovir,培养基中被杀死；,3,号未发生任何重组，为正常细胞，在,G418,培养基中被杀死。,抵抗,G418,的基因,tk,基因,B,、制备基因敲除动物（小鼠）,1,、,将发生同源重组的胚胎干细胞导入来自黑色的小鼠胚泡中（形成嵌合体胚胎，两套基因物质）,2,将胚泡植入假孕小鼠子宫中发育。,3,、诞生出杂合的嵌合体小鼠，具黑毛和褐色毛，,胚胎干细胞来自褐色小鼠,，,正常胚胎来自黑色小鼠。,4,、嵌合体小鼠与野生黑色小鼠交配，产生纯黑色与纯褐色的后代小鼠，其纯褐色小鼠为杂合子，有一目的基因已被敲除。,5,、近亲交配，产生纯合子基因敲除小鼠（第四代）。,打靶载体,内切酶消化,线性化打靶载体,转染,基因组,同源重组,同源重组的胚胎干细胞,胚泡,植入,假孕小鼠,杂合子小鼠,正常小鼠,杂合子小鼠,交配,杂合子小鼠,兄妹交配,纯合子小鼠（基因剔除）,黑色雌性大鼠,来自褐色大鼠,B,、制备基因敲除动物（小鼠）,1,、,Neo,r,（,neomycin-resistance gene),基因：阳性筛选标志，使细胞具有抵抗新霉素（,G418,）能力。,2,、胸苷酸激酶,(thymidine kinase),的作用：阴性筛选标志，分解底物为,gangcyclovir,杀死细胞（自杀基因）,新霉素抗性基因,(neo),是真核表达载体的常用筛选标志,neo,基因编码新霉素磷酸转移酶,(NPT),能催化,G418,、卡那霉素等多种氨基糖苷抗生素分子磷酸化而使之失去抗菌活性,建立动物模型,目前已建立的动物模型如,-,地中海贫血，高脂蛋白血症，阿尔茨海默氏病等。,四、基因转移和基因剔除在医学发展中的作用,基因诊断和基因治疗,第九节,Gene Diagnosis and Gene Therapy,（一）、定义,直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法,。,一、基因诊断,(Gene Diagnosis),（二）、特点,针对性强；特异性强；灵敏度高 ；适应性强,DNA,序列分析,PCR,技术（测序，限制酶酶切图谱）,3,、基因芯片,(gene chip),4,、分子杂交,（三）、基因诊断常用技术方法,(,四,),、基因诊断的应用,1,、遗传疾病,2,、感染性疾病，传染性流行病,3,、肿瘤,4,、法医学应用，亲子鉴定等,5,、器官移植组织配型,例,：,1,、遗传性疾病如诊断地中海贫血，血友病，苯丙酮尿症，产前诊断等,2,、传染病如诊断,HIV,SARS,乙肝病毒等，病原微生物,3,、对肿瘤的早期诊断：检测,p53,基因突变，,17,号染色体，据悉，人类恶性肿瘤,5060%,与该基因突变有关，美国,Affymeri,公司已把,p53,基因核心区（结合结构域,),酸性区（转录活化），碱性区（转化区）中的已知突变序列制作成了探针，集成在基因芯片上用以检测所有,p53,编码区的错义突变，及单碱基缺失，插入等，预测癌症的发生，早期诊断，主要检测,58,外显子，现已有检测肺癌的芯片,.,准确率,80%,？,A,B,酶切位点,A.,正常人,珠蛋白基因,B.,镰刀型贫血病人,珠蛋白基因,HpaI,7.6Kb,6.4Kb,1.,分子量,Marker,2.,正常人,珠蛋白基因酶切图谱,3.,镰刀贫血病人,珠蛋白基因酶切图谱,1,2,3,电泳方向,电泳图谱示意图,4,、在法医学的应用,(DNA fingerprinting,）,A.Jeffreys,，英国，,1985,，首先利用串联连接的短重复序列,Variable Number of Tandem Repeas VNTRS(,两酶切位点间序列重复的次数不同，因而酶切后的片段长度不同）的高度多态，个体差异，含酶切位点数不同,（,STR).,Hinf I,HaeIII,5,ATAAACT ATAAACT ATAAACT,3,3,TATTTGA TATTTGA TATTTGA,5,检测某些基因座（用几套探针,),能非常明确的鉴定个体和家庭的相关性。只有单卵双生，可完全一样。,表示重复序列,DNA,指纹分析,(DNA fingerprinting),近年研究发现，人类基因组中许多位点存在着一种可变串联重复序列,(variable number of tandem repeat,，,VNTR),。这种,VNTR,主要存在于基因的非编码区，重复序列是头对尾串联排列着。人类某些,VNTR,是由,20-50,个重复单位组成,，每个单位含,15-100 bp,，,DNA,的长度为,1kb,至,5kb,，,较普通卫星,DNA,（约,100 kb,）小，所以称为小卫星,DNA,（,minisatellite DNA,）。经研究发现,VNTR,有高度的多态性，在人群中的分布表现高度的个体特异性，甚至同一个体同源染色体的等位,VNTR,的重复单位数也不同，等位基因按孟德尔方式遗传。,VNTR,区的重复单位数目不同，所以该区的,DNA,长度不同。但每一位点,VNTR,的核心序列却有高度的保守性，因此可认为,VNTR,是一种判断个体差异的遗传标记。,1985,年，,Jeffreys,根据,VNTR,的特点，选择某些核心序列作为探针，并选用核心序列无切割位点的限制性内切酶如,Hin,f1,，对,DNA,样品进行酶解，然后作,Southern,印迹,。图谱显示不同个体具有不同条带，如同一个人的指纹具有高度的个体特异性一样，因此把这种,Southern,印迹图称作,DNA,指纹图谱,(DNA fingerprint).,可变串联重复序列（,VNTRS,），小卫星序列,8,个片段,将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用,以治疗疾病的方法，称为基因治疗。,二、基因治疗,(,Gene Therapy),（一）、定义,（二）、基因治疗的基本策略,1,、,基因矫正，基因置换,2,、基因增补,3,、基因失活,4,、基因疫苗,5,、免疫调节,几种常见的基因失活技术,反义核酸技术,核酶技术,干扰,RNA,技术,基因治疗的其他方法：如,“,自杀基因,”,的应用，基因疫苗等,基因失活,干扰,RNA,（,RNAi,）的调控,近年来的研究表明,一些小分子双链,RNA,通过特异性结合互补链，促使目标,mRNA,降解，从而特异地抑制体内特定基因的表达，导致细胞表现出特定的基因缺失表型，引发转录后沉默（,Post-transcriptional gene silencing,，,PTGS,），称为干扰,RNA,（,RNA interference,，,RNAi,）。,（三）、基因治疗的基本程序,1,、治疗性基因的选择,2,、基因载体的选择,3,、靶细胞的选择,4,、基因转移，转化,（转入受体细胞）,5,、外源基因表达的筛选,利用标记基因,6,、回输体内,病毒载体,非病毒载体,体细胞,间接体内疗法,直接体内疗法,筛选标志：,新霉素磷酸转移酶，,G418,（遗传霉素）,*,基因治疗的应用实例,1,、对,ADA,缺乏症的治疗,（,SCID,，复合型重症免疫缺乏综合症）。,2,、对遗传性高胆固醇血症的治疗,3,、对肿瘤的治疗,转氨基偶联嘌呤核苷酸循环,苹果酸,腺苷酸,代琥珀酸,次黄嘌呤,核苷酸,(IMP),腺苷酸代琥,珀酸合成酶,-,酮戊,二酸,氨基酸,谷氨酸,-,酮酸,转氨酶,1,草酰乙酸,天冬氨酸,转氨酶,2,此种方式主要在肌肉组织进行,。,腺苷酸,脱氨酶,H,2,O,NH,3,延胡索酸,腺嘌呤,核苷酸,(AMP),1,、遗传性单基因疾病（,monogenic diseases,）是基因治疗的理想侯选对象，例如腺苷脱氨酶,ADA,缺乏的严重联合免疫缺陷（,SCID,），由于淋巴细胞缺乏,ADA,酶，造成腺苷及,dATP,的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞,ADA,恢复至正常水平的,5%,10%,即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。,又例如,有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，,但那些有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如,Parkinson,症是脑黑质细胞（,substantia nigra,）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（,dopamine,），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。,2,、对遗传性高胆固醇血症的治疗,3,、对恶性肿瘤的治疗,恶性肿瘤属复杂基因疾病,(complex genetic diseases),，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因,治疗策略有十余种之多。,1),、免疫基因治疗,(immunogene theray),分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如,IL-2,、,IL-12IFN-,等转导肿瘤细胞作为基因工程,“,瘤苗,”,，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导了细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。,本实验室研究了,IL-2,基因转导的人肝癌和胃癌细胞,“,瘤苗,”,，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或,MHC I,类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。,免疫逃逸,2),、,自杀基因系统,自杀基因（,suicide gene,）,来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（,thymidine kinase,TK,）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（,gancilovir,GCV,）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的,DNA,链，造成,DNA,链的断裂和抑制,DNA,聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将,HSV-tk,基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用,GCV,药物，肿瘤细胞表达,TK,基因能使无毒的,GCV,转变成有毒的三磷酸,GCV,，达到杀伤肿瘤细胞的目的。,3),、抑癌基因,(tumor suppressive gene),抑癌基因,p53,的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型,(,正常,),的,p53,转导,p53,缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的,p53,产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。,基因治疗,自杀基因被导入肿瘤靶组织,复习题,1,、,PCR,的基本原理？,PCR,反应体系包括哪些组分,?,常用,PCR,有哪些及其应用。,2,、,DNA,测序需用哪些酶与底物？简述,DNA,测序的原理。,3,、简述酵母双杂交原理？钓饵蛋白和猎物蛋白的作用及如何证明蛋白质之间发挥了相互作用。,4,、比较转基因，动物克隆和基因敲除的概念。,复习题,1,、何谓基因诊断？,基因诊断常用技术方法？,有哪些应用。,2,、基因治疗常用的方法？基因治疗的基本程序。世界上第一例实施基因治疗的疾病是什么？,第八节,疾病相关基因的克隆与鉴定,Cloning and Identification of Disease Relative Genes,功能克隆,(functional cloning),定位克隆,(positional cloning),克隆疾病相关基因的策略,定义,从对一种致病基因的功能的了解出发来克隆该致病基因。,（一）功能克隆,应用,生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。,用不同人的,DNA,片段转化与人类遗传疾病具有类似表型的突变酵母，可以恢复,(,rescue),正常表型的片段,中所含有的基因,即可能为致病基因。这种实验称为,功能互补试验,(functional complementation assay),。,（二）定位克隆,定义,从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,系统的定位克隆工作,遗传学分析,(,确定致病基因染色体定位,),交换分析、连锁不平衡分析,分子生物学分析,染色体异常,(,缺失、易位等,),分析、基因文库的筛选与基因克隆,