第三章-非细胞型微生物--病毒.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 非细胞型微生物 -病毒,概述,病毒病的流行特点,病毒学简史,学习病毒的目的,病毒病的流行特点,（1）持续稳定流行,如病毒性肝炎,我国年发病率1,.76%,全国,7,8,亿感染过甲肝，,6,7,亿乙肝，,1.2,亿乙肝病毒携带者,每年增加病毒性肝炎患者,1700,万,每年因肝病死亡,30,万人,每年经济损失223亿元,（2）暴发性,1988 年上海甲肝暴发流行,1988 年14月，34 万人发病（,40.82,）,2039,岁，中青年，,83.5%,食用污染毛蚶,230,万人食用，,34,万发病,流感1918年，死亡2000万（第一次世界大战死亡1000万）,高致病性禽流感-2004年,甲型H1N1-2009年,（3）新病毒病不断出现,AIDS,1981,年，美国，首例,现全球，,210,多国家、地区,每天新增,1.6,万人（主要儿童）,“蜱咬病”元凶-,新布尼亚病毒,2011年03月21日,新布尼亚病毒是发热伴血小板减少综合征的病因,临床表现和流行病学特征：患者的主要症状是发热、消化道症状、血小板减少、白细胞减少、肝肾功能损害，部分患者有出血表现。该病主要发生在丘陵、山区，患者以成年农民为主，部分患者被蜱叮咬过。发病的流行期为4-10月，流行高峰为5-7月，这也是蜱虫活跃的时间段。,（4）流行稳定上升,由原来发病率低，局部区域流行，向大规模流行趋势发展,流行性出血热,中越、中苏边境,610万,/,年速度上升,死亡率,6,20,，每年死亡,10000,人,（5）性质不详，待研究,有些疾病已知是病毒引起，但病原性质不详,如人类：70中枢神经系统急性感染、2030肠道病、50呼吸道疾病的病原性质不祥,估计有120种病毒有待发现,（6）非寻常病毒,区别于经典病毒的一类致病因子,亚病毒（,Subviruses,）,Subviruses:,类病毒（,viroid,）、拟病毒（,virusoid,）,朊病毒（,virino,），蛋白质感染因子（,prion,）,学习病毒学的目的、意义,一专业知识结构的需要,生物科学、生物技术涉及领域：医学、医药、卫生、检疫、环境等,继续生命科学研究,二、学科发展需要,微生物学一部分,20世纪60年代，独立成病毒学,与分子生物学、基因工程等结合，地位突出,病毒学成果，丰富分子生物学内容，在基因工程中得到应用,分子生物学技术，促进病毒学发展,三,、认识病毒、与病毒病作斗争,急性传染病中，70病毒病,病毒病特点：,发病率高、传染性大、治疗难度大、死亡率高、社会影响大、经济损失大,二、,病毒学知识的起源与病毒学发展简史,从病毒学知识起源到学科建立,四个阶段：,1、启蒙和经验阶段,2、机体水平研究阶段,3、细胞水平研究阶段,4、分子水平研究阶段,1启蒙和经验阶段,公元10世纪1892年，900年历史,事实上，有些疾病已经有上千年历史，但当时并不知道由病毒引起,“天花”-,是有人类历史以来就存在的可怕疾病,，自1977年以后世界上没有发生过天花。,启蒙和经验阶段,公元前3世纪传入希腊,公元10世纪，宋真宗时代，人工免疫预防,痂皮，保存减毒，鼻腔接种,18世纪，丝绸之路，中东土耳其等，欧洲,1798年（700年后），英国,Edward Jenner,发现牛痘与人痘的相似性，与病牛接触的挤奶妇女很少得天花，“种牛痘”,1884,年，法国,Pasteur,，狂犬病疫苗,3000BC，埃及孟非思壁画中长老患小儿麻痹症。,启蒙和经验阶段,植物病毒方面：,17世纪初，荷兰,郁金香杂色彩条病,花瓣色素分布发生,变化，出现明暗,相间条斑，形似“花裂”,郁金香碎裂病毒,17世纪荷兰油画证明,启蒙和经验阶段,人类很早就开始接触病毒性疾病,但病毒是什么？一直到19世纪末，才开始有一些初步研究和认识,2、机体水平研究阶段,1892年20世纪40年代,人类认识病毒过程中，烟草花叶病病毒（,Tobacco Mosaic Virus,，,TMV,）起了很大作用,机体水平研究阶段,1886年，德国,Adolf Mayer,，传毒试验，叶脉注射,受,Pasteur,细菌学影响，认为细菌引起,1892,年，俄国,Dmitrii Ivanowski,改进,瓷质微孔滤器，细菌不能通过,提出非细菌观点，细菌毒素,机体水平研究阶段,1898年，荷兰马丁乌斯贝杰林克,（,Martinus Beijerinck,）验证,三个特点（1）通过滤器；（2）细胞内繁殖；（3）体外非生命物质中不能生长,正式提出烟草花叶病的病原不是细菌，而是一种比细菌小得多的传染性活体物质（传染性活质）,机体水平研究阶段,传染性活质是：,一种侵染因子,能繁殖,处于分散状态的生命体,首次称这种致病因子为“,Virus,病毒,”,由于能通过细菌滤器，称“滤过性病毒”,机体水平研究阶段,Ivanowski,和,Beijerinck,开创性工作，揭开了现代病毒学研究序幕,病毒学奠基人,病毒学之父伊凡诺夫斯基，俄罗斯,著名科学家1892年发现,烟草花叶病病原的滤过性,贝杰林克（1851-1931）,荷兰著名科学家，1898,年发现病毒,机体水平研究阶段,病毒概念提出后，迅速发现动物中也有相似的病原因子，广泛存在于自然界,1898,年，口蹄疫病毒具有可滤过性,机体水平研究阶段特点：,采用敏感动植物，动物胚胎（鸡胚）,机体水平研究病毒繁殖、发病机理、免疫反应等,病毒概念被提出、确认，病毒学开始形成,但尚未形成独立学科，微生物学分支,机体水平研究阶段特点,关于病毒是什么样子？本质是什么？,1892年后长达30年，一直是谜,1939年，第一批电镜诞生,首先观察到的是,TMV,3、细胞水平研究阶段,20世纪4060年代，20年,特点：,离体组织培养技术发展，建立了大量适合于病毒生长的细胞株（系），研究模型,病毒复制、遗传、与细胞相互作用规律,细胞水平研究阶段,诞生了一批经济、安全的组织培养疫苗,脊髓灰质炎疫苗、麻疹、风疹、腮腺炎等,病毒学在理论和实际应用上都有了迅速发展,逐步形成一门独立学科,4、分子水平研究阶段,60年代至今,1953年,分子生物学诞生,新技术、方法应用,特点：,相继阐明了,DNA,、,RNA,病毒的繁殖机制,基因组被克隆，基因序列得到阐明,发现了一类亚病毒,分子水平研究阶段,利用,DNA,重组技术，诞生了一批基因工程疫苗,如乙肝疫苗,抗病毒多肽物质，如干扰素（,interferon,，,IFN,）,1979,年，从白细胞分离，,800Kg,人血提取,1mg,，,1gIFN 1.2,亿美元,现每升菌液,1mg,学习病毒学目的,认识、利用、改造、控制,中国科学院院士朱既明医学病毒学家田波植物病毒学家谢联辉植物病毒学家毛江森医学病毒学家,第一节 病毒的形态与结构,一、病毒的概念,Virus is the smallest microorganism that only grew and replicated in the cells.,病毒与其他微生物的区别,不具有细胞结构；也不进行蛋白质、糖和脂类的代谢活动。,只含有一种核酸成分，要么,DNA,，,要么,RNA,。,特殊的繁殖方式。缺乏完整的酶系统，不具备生物产能所需的遗传信息。,绝对的细胞内寄生物。,对一般抗生素和作用于微生物代谢途径的药物不敏感。,绝大多数病毒在不同程度上对干扰素敏感。,病毒的概念,(,一,),真病毒：,体积小，结构简单，只有一种类型的核酸，只能在活的、敏感细胞内以复制方式增殖的非细胞型微生物。,(,二,),缺损病毒：,某些病毒由于缺乏某些基因，单独感染细胞时不能复制出完整的具有感染性的病毒颗粒，需其他病毒基因组或病毒基因的辅助活性，否则即使在活细胞内也不能复制。,干扰缺损病毒（,DI,病毒）,：,卫星病毒：,条件缺损病毒：,整合的病毒基因组：,(三)亚病毒：,比,病毒更加简单，只有一些小分子量的核酸或者只是一种蛋白质,。,这些具有感染性的物质称为亚病毒,;,主要包括,朊病毒、类病毒。,Prion,(,朊病毒或传染性蛋白颗粒,),：是指一类没有核酸，而完全由传染性蛋白质颗粒引起机体感染的微小病原体。,类病毒（,Viroid,）：,是一类比病毒更小的病原体，在电镜下也不能看到其形态结构，核酸的分子量仅为最小病毒的,10%,。即病毒的核酸是裸露的，没有蛋白质外壳。,(四)描述病毒的基本概念,长短、大小、密度、沉降系数,长短：病毒,-,用纳米表示（,nm,）。,大小：用分子量表示 核蛋白分子（核酸与蛋白质以一定方式组合），如,380010,6,道尔顿,密度：浮力密度（采用密度梯度离心方法测定，需注明介质（介质不同，,不同）。,沉降系数,:,单位离心力作用下的沉降速率（,s,）。,二、病毒的大小和形态,病毒体积非常微小，能通过细菌滤器，用光学显微镜看不见，只能借助电子显微镜才能看见，测量时用nm来测量。,大的病毒如痘病毒为300nm，中等大小为50250nm,大多数100nm左右，小病毒可小于20nm。,(一)病毒的大小,完整的成熟病毒颗粒，具有典型的形态结构，并有感染性。,150nm,大型病毒（最大300 nm）,微生物的大小比较,葡萄球菌,(1000nm,）,牛痘病毒,300,250nm,A,B,C,D,E,F,G,立克次体,450nm,衣原体,390nm,A、大肠杆菌噬菌体,(65,95nm),B、腺病毒,(70,nm,),C、脊髓灰质炎病毒,(30,nm),D、乙脑病毒,(40,nm),E、蛋白分子,(10,nm),F、流感病毒,(100,nm),G、烟草花叶病毒,病毒的形态多样，有球形、杆形、子弹形、砖形、蝌蚪形等各种形态,。,1.有囊膜的病毒有三类形状：,砖形-如痘病毒；,子弹状-如狂犬病病毒；,近似圆形-如大多数病毒。,2.无囊膜病毒的形状有两类：,圆形，即二十面体立体对称型；,圆柱形，实质上是螺旋对称型。,3.细菌病毒-多为蝌蚪状。,(二)病毒的形态,砖形病毒,弹状病毒,杆状病毒,病毒的形态,病毒的形态,蝌蚪形噬菌体,球形病毒,电镜下的多瘤病毒,电镜下的流感病毒粒子,艾滋病 病毒(HIV),Fig.Sizes and Shapes of Viruses(Animal RNA Viruses),Fig.Sizes and Shapes of Viruses(Animal DNA Viruses),Transmission Electron Micrograph of Herpes simplex Viruses（疱疹病毒）,广义上：所有生物都能被病毒感染；,狭义上：不同的生物具有病毒的特异性。,噬菌体：细菌的病毒；动物病毒动物；植物病毒植物；存在相互交叉的现象。,过客病毒,：某一病毒对某宿主无致病性，则该病毒称为此宿主的过客病毒,病原病毒,：某一病毒对宿主有致病性，则该病毒称为此宿主的病原病毒,三、病毒的宿主范围,病毒的基本结构由,核酸,（核心）和,核壳,（衣壳）（capsid），两者组成,核衣壳,(nucleocapsid)。,如果该病毒体无包膜，那么核壳体就是病毒体，这样的病毒体是裸露的病毒体。,有感染性的完整病毒颗粒叫,病毒体,（virion）。,四、病毒的结构,病毒体结构模式图,壳粒,衣壳,核心（核样物）,核衣壳,包膜,包膜病毒,包膜子粒,核心,：,核酸 基因组,genome,决定病毒遗传、变异,和复制,壳粒,capsomere,衣壳,capsid,保护、介导、抗原性,包膜,envelope,，包膜子粒,peplomere,（,刺突,spike,）,保,护、介导、抗原性,Viral Structure(Enveloped Helical Virus),Viral Structure(Enveloped Polyhedral Virus),弹状病毒,(一)病毒的核酸,病毒核心,(viral core),：,由,DNA,或,RNA,组成，是病毒的基因组，位于病毒的内部，病毒的基因只能是,DNA,或,RNA,的一种，同一个病毒体内不可能同时具有两种核酸。,病毒基因组的功能是：,(1),指导病毒复制；,(2),决定病毒特性；,(3),具有感染性。,1核酸的类型,核酸分为两大类，即,DNA,和,RNA,。,病毒只含有其中一种，不会有两者同时存在。即使是同一类核酸，它们的结构也多种多样。,DS DNA,、,SS DNA,、,SS RNA,、,DS,RNA,一般病毒的核酸链呈线状，但也有病毒的核酸呈环状,2核酸的分子量,病毒核酸分子量以原子质量单位为标志，以百万（,10,6,）计。,(二)病毒的衣壳,病毒衣壳(viral capsid)：由病毒指导合成的蛋白质组成，衣壳由一定数目的壳粒组成，不同的病毒核酸形态和结构不同，壳粒的数目和排列也不同，核酸和壳粒按一定的方式排列成不同的对称类型。,一般有以下三种：,二十面体立体对称型;螺旋对称型;复合对称型。,病毒衣壳的功能是：,(1),保护核酸，,(2),参与感染，,(3),具有抗原性。,病毒的衣壳,1.,二十面体对称,（Icosahedral Symmetry）,这种衣壳由,20,个等边三角形构成。,病毒样本经负染后在电镜下观察时，在衣壳上看到排列规则的圆形颗粒，称为,壳粒,（capsomer），它是一种形态亚单位，电镜下壳粒是呈对称性排列。每一个壳粒基本上由5个或6个原体构成，前者称五邻体，后者称六邻体。,20面体衣壳的壳粒排列依照,结晶学法则,。,除痘病毒外，所有脊椎动物DNA病毒,均为20面体,。RNA病毒中不少科也是20面体。,二十面体病毒,五邻体,六邻体,病毒的衣壳,2.,螺旋状对称,（Helical Symmetry）,病毒衣壳呈螺旋状的空心圆珠笔筒，它的结构比,20,面体衣壳简单得多。壳粒排列一般不太紧密，因此核衣壳容易弯曲，但也有不易弯曲者，如弹状病毒。,在动物病毒中螺旋状对称的病毒均属有囊膜的单股,RNA,病毒,。,RNA,壳粒,螺旋对称的病毒粒子,Tobacco Mosaic Virus,核衣壳的对称形式,Symmetry of Nucleocapsid,3.,复合对称：,（Complex Symmetry）,具有复合对称壳体结构的典型子是噬菌体,复合对称的病毒粒子,T,4,Bacteriophage,(三)病毒的囊膜,病毒囊膜,(viral envelope)：磷脂双层液态镶嵌模型的生物膜，将病毒衣壳包裹在内部。有些病毒的囊膜表面具有刺突。,囊膜的功能:,维持完整性；,细胞膜亲和、融合性能；,表现病毒种、型抗原特异性。,有些病毒还有其他辅助结构，如,腺病毒,外有触须样纤维。,五、病毒的化学组成,病毒由,核酸和蛋白质组成,。,某些病毒，特别是动物病毒，,还常含有脂质、糖类和少量的其他成分,。如流感病毒含59%的多糖类、11%的磷脂和6%的胆固醇。,1.核酸,核酸是病毒遗传信息的物质基础。病毒只含有一类核酸（DNA或RNA）一般来说，病毒粒子愈大，其所需的核酸量愈多。,核苷酸序列测定是病毒核酸组分的直接依据。许多病毒的核苷酸序列已被测知。,2.蛋白质,蛋白质是病毒的又一重要组成成分。病毒蛋白的主要功能是,对病毒核酸形成保护性外壳,；,二是参与病毒粒子对细胞受体的吸附。,病毒粒子表面的蛋白质对于敏感细胞受体的特殊亲和力，是某些病毒感染必不可少的前提。,病毒蛋白具有较高的,毒性作用,，是使动物机体发生,各种毒性反应的主要成分,。如发热等。,病毒粒子中的蛋白质分为4种：即衣壳蛋白、基质蛋白、囊膜蛋白和酶蛋白。,基质蛋白位于外层脂质和衣壳之间，如流感病毒的内膜蛋白，起到维持病毒内外结构的作用。,囊膜蛋白主要是糖蛋白，位于囊膜表面。,3.酶类,病毒可以利用细胞内原有酶系统，但病毒增殖过程中的某些环节的酶是病毒特有的。如转录酶。,病毒粒子中的酶在功能上分为两类：,一类使细胞的细胞膜成分降解,，如流感病毒的神经氨酸酶。另一类酶则,与病毒核酸的合成和降解有关，,如许多病毒的转录酶和复制酶。此外还有蛋白激酶。,即使某些病毒含较多的酶，但不可能具有核酸和蛋白质合成所需要的完整的酶系统。,4.脂质,病毒粒子的脂质，主要存在于囊膜中。病毒脂质来自细胞，是病毒在成熟释放过程中从宿主细胞获得的。,以脂质为基架形成的病毒囊膜在复制过程中，如病毒的吸附、侵入和释放占有重要地位。,由于囊膜的主要成分为类脂，因此用乙醚、氯仿、脱氧胆酸钠等处理时，可迅速将其破坏，从而使病毒丧失致病力。此法称为,乙醚敏感试验,，间接证明病毒有无囊膜,5.糖类,某些动物病毒含有少量糖类，如正粘病毒、疱疹病毒和痘病毒。糖类以糖蛋白的形式存在于病毒囊膜中。,病毒粒子的糖类在,病毒粒子吸附和侵入细胞的过程中呈现一定作用,。,糖蛋白还是重要的,免疫源,，如抗流感病毒血凝素的免疫血清具有明显的病毒中和作用。,病毒的糖类也来自宿主细胞。,第二节 病毒的复制,在弄清病毒感染的致病机理以前，了解病毒如何侵入细胞而后增殖的各个环节是很有意义的。它是实验病毒学的中心课题，早在40年代就有不少学者以噬菌体作为研究模型，到60年代人们开始把注意力转移到动物病毒。,研究病毒的增殖过程和生物合成，不仅关系到病毒病的防治，而且涉及生命起源和肿瘤学等重大理论和实践课题。,致瘤特性的病毒约有150多种。许多DNA病毒能在一定条件下引起动物肿瘤，RNA病毒中则只有反转录病毒具有致瘤作用。,细胞,病毒的增殖场所,一、病毒的增殖周期,所有动物病毒的增殖都涉及到,下列过程,，即,病毒吸附到易感细胞表面,、,穿入细胞内，脱去衣壳和暴露核酸，转录信使RNA(mRNA)，转译功能蛋白和结构蛋白、复制子代核酸，子代病毒的装配并最后从宿主细胞释放出来。,有些病毒在释放前还要加上一层囊膜。,病毒的复制过程,二、病毒复制的过程,(一)、,吸 附,病毒感染细胞时首先要吸附在细胞上。,这一过程的第一步是静电吸引。,pH,对电荷有影响，适宜的,pH,范围有时要求不严，有时却很苛刻。,第二步是特异性吸附。静电吸引导致的吸附是可逆的，要形成牢固的结合必须在细胞膜表面有与该病毒相匹配的受体。受体的化学成分多数为糖蛋白，偶尔是糖脂、唾液酸寡糖苷或脂蛋白。,1.吸附结构,（absorption）,是决定感染成功与否的关键环节。,需要病毒表面特异性的吸附蛋白（,Virus attachment Protein,VAP,）,与细胞表面受体（也称为病毒受体，,virus receptor,）,相互作用。,(1).,病毒的吸附蛋白：,一般由衣壳蛋白或包膜上的糖蛋白突起充当,如:T偶数噬菌体的VAP是噬菌体尾部的尾丝蛋白；,副粘病毒的HN糖蛋白，流感病毒的血凝素（HA）糖蛋白，HIV的gp120糖蛋白，弹状病毒的G糖蛋白，疱疹病毒的gpB糖蛋白等囊膜病毒包膜上的糖蛋白突起是一种VAP。,(2).细胞表面受体（病毒受体）:,是宿主基因组编码、控制和表达的一组蛋白质,能够与病毒吸附蛋白产生特异性结合,介导病毒侵入细胞,启动病毒感染的特殊性细胞表面位点。,在病毒受体的介导下,病毒最终进入细胞进行复制。因此,细胞上的病毒受体与病毒的宿主范围和组织嗜性密切相关。,一个细胞上对不同病毒的受体数目均不相同，一般为10,4,10,5,个。,受体具有特异性，,表现在几个方面：,一是动物种类：,-,如猪瘟病毒的受体只存在于猪细胞上，但水泡性口炎病毒的受体在很多种动物的细胞上都有,。,二是细胞种类：,-,如牛白血病病毒只感染B淋巴细胞，口蹄疫病毒感染上皮细胞等。,三是病毒种类：在同一细胞上，不同病毒需要不同受体，但有些抗原性和生物学特性迥异的病毒有时受体却相同。,在病毒方面，囊膜上的纤突可能就是吸附于细胞受体的结构。没有囊膜的病毒则可能由衣壳上的某种多肽，或者某种结构来吸附。,缺损病毒主要生物学意义,1、基因转移与表达：,已发现，缺损的乳多空病毒和腺病毒，经常携带少量宿主细胞基因。这些基因可随缺损病毒的感染而转移给另一细胞，并且有所表达。,2、毒力调节：,尤其是DI颗粒和卫星病毒因具有明显的干扰完整病毒复制的作用，在自然感染时，起着减弱完整病毒感染力气作用。,3、病毒与宿主的进化：,缺损病毒转化的细胞，已将病毒的插入基因作为自身成分并代代相传。同样，许多病毒推广应用厂家部分细胞基因，并继续传给子传病毒。,HIV infection in human lymph tissue,各,种,病,毒,受,体,可逆吸附（非特异）：,由随机碰撞、布朗运动、静电引力引起，,VAP,与,VR,之间并未产生化学键结合，因此易受环境中,PH,的影响。,不可逆吸附,:,实质是,VAP,与,VR,形成牢固的化学键结合，同时伴随病毒粒子体结构的显著改变。,2.吸附过程：,(峡谷学说)病毒吸附蛋白与敏感细胞表面特异性受体相互识别、结合，分两个阶段：,3.影响吸附的环境因素:,（1）温度:,一般在037 内温度越高,吸附效果越好:,（2）离子:,细胞受体蛋白和VAP均趋带负电荷,Na+、K+可促进骨髓灰质炎病毒、腺病毒、流感病毒吸附；Ca2+、Mg2+可促进噬菌体吸附。,（3）PH值：,改变病毒粒子和细胞表面基团的电荷；影响VAP和VR的空间构象，使两者易于匹配。,（4）其他因素：,某些糖基分子的竞争性结合抑制，如单糖分子抑制人肠道病毒的血凝作用；色氨酸可,使T4噬菌体的尾丝从尾鞘上伸展，促进吸附。,意义,研究病毒的吸附过程对了解受体组成、功能、致病机理以及探讨抗病毒治疗有重要意义。,(二)、穿入(侵入),动物、植物和细菌的细胞被病毒侵入的方式各有其特殊性，因为它们的细胞壁的本质各不相同。,植物细胞有纤维素组成的坚硬细胞壁，细胞壁经昆虫咬伤或机械擦伤后病毒才能侵入。,细菌有不太坚实的细胞壁，一部分噬菌体(双股DNA)依靠尾端的溶菌酶将细胞壁溶一小孔，将尾管刺入，注入头部的核酸，而衣壳留在外面。,动物细胞没有细胞壁，通常病毒核酸连同衣壳一起侵入细胞内，但侵入方式因病毒而异。,侵入方式：,1.注射式侵入：,一般为有尾噬菌体的侵入方式。通过尾部收缩将衣壳内的,DNA,基因组注入宿主细胞内，侵入与脱壳同步进行。,2.细胞内吞：,动物病毒的常见侵入方式。经细胞膜内陷形成吞噬泡，使病毒粒子进入细胞质中。,病毒受体介导细胞内吞,那么在细胞内的吞噬泡的命运是如何呢？,依然存在于细胞质中，不与溶酶体结合，病毒侵染活性被吞噬泡所遮蔽；,与溶酶体结合，病毒粒子被彻底酶解；,在吞噬泡与溶酶体结合前，以某种机制逸出吞噬泡；,与溶酶体结合，其衣壳被消化释放出病毒基因组进入细胞质中；,吞噬泡移至病毒脱壳的部位（胞质或胞核），然后病毒粒子从中逸出再进行脱壳；,吞噬泡移到细胞膜附近，经与细胞膜融合而将病毒粒子重新释放到细胞外。,3,.,膜融合：,包膜和细胞膜脂质分子的相互作用，以及某些蛋白因子的参与，使得病毒包膜和细胞膜发生融合，形成融合泡，继而病毒侵入细胞。,病毒包膜和细胞膜发生的一定变化，如细胞膜的流动性改变；在病毒包膜糖蛋白的影响下，细胞膜上一些蛋白分子产生聚集，主要是病毒受体迁移形成受体位点或受体区；细胞膜上的脂质分子重排以及病毒包膜和细胞膜脂质分子发生交换。,4.直接侵入：,大致可分为三种类型,部分病毒粒子直接侵入宿主细胞，其机理不明。,病毒与细胞膜表面受体结合后，由细胞表面的酶类帮助病毒释放核酸进入细胞质中，病毒衣壳仍然留在细胞膜外，将病毒侵入和脱壳融为一体。如脊髓灰质炎病毒与受体接触后，衣壳蛋白的多肽构形发生变化并对蛋白水解酶敏感，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外。,其他特殊方式，植物病毒。,(三)脱壳,（uncoating）,病毒感染性核酸从衣壳内释放出来的过程.,有包膜病毒脱壳包括脱包膜和脱衣壳两个步骤，无包膜病毒只需脱衣壳，方式随不同病毒而异。,注射式侵入的噬菌体和某些直接侵入的病毒可以直接在细胞膜或细胞壁表面同步完成侵入和脱壳。,病毒粒子以内吞方式或直接进入细胞后，经蛋白酶的降解，先后脱去包膜和衣壳。,以膜融合方式侵入的病毒，其包膜在与细胞膜融合时即已脱掉，核衣壳被移至脱壳部位并在酶的作用下进一步脱壳，病毒核酸游离并进至细胞的一定部位进行生物合成。,病毒脱壳必须有酶的参与，脱壳酶来自宿主细胞，有的为病毒基因编码（如,痘病毒,）。,脱壳后、开始干什么呢？,隐蔽期从病毒脱壳开始直到子代病毒出现这一阶段称为病毒隐蔽期。此时病毒丢掉完整可见的形态，同时失去了感染性。,隐蔽期实际上是病毒增殖过程的主要阶段。,(四)生物合成,（biosynthesis）,“,生物化学的政变,”,利用宿主的RNA聚合酶合成病毒mRNA，它对细胞rRNA重新加以规划，指导它们合成病毒的“产品”而不是细胞的“产品”蛋白质,感染战略由被动利用转为主动利用,病毒的生物合成,以mRNA序列为标准，将RNA和DNA分子区分为正链、负链，以此为根据将病毒分为6种类型，即：双股DNA（dsDNA）病毒、单股DNA（ssDNA）病毒、双股RNA（dsRNA）病毒、正股RNA（+ssDNA）病毒,、负股RNA（-ssRNA）病毒、反转病毒。,不同的病毒的生物合成是各有差异的,五.装配（,assembly,）及释放,病毒的结构成分核酸与蛋白质分别合成后，在细胞核内或细胞质内组装成核衣壳。,绝大多数DNA病毒在细胞核内组装，RNA病毒与痘病毒类则在细胞质内组装。无包膜病毒组装成核衣壳即为成熟的病毒体，病毒的早期蛋白，即非病毒结构成分不组装入病毒，残留在感染细胞中。,释放（release）：,绝大多数无包膜病毒释放时被感染的细胞崩解，释放出病毒颗粒，宿主细胞膜破坏，细胞迅速死亡。,绝大多数有包膜病毒通过细胞内的内质网、空泡，或包上细胞核膜或细胞膜以出芽方式释放而成为成熟病毒，在一段时间内逐个释出，对细胞膜破坏轻，宿主细胞死亡慢。,释放出来的子代病毒粒子再遇到适宜的敏感细胞时，又可以重新产生感染，并启动新一轮的复制循环。,释放的三种常见形式：,裂解释放,出芽释放（反吞饮释放）,有些病毒不释放到细胞外，仍留在细胞内，形成包涵体或通过细胞间膜融合进行转染。,电镜下看到的新产生的病毒粒子从细胞表面以出芽方式释放,第三节 病毒的培养,病毒是严格细胞内寄生的，在无细胞条件下，即使所用的营养液非常完美，也不能使其繁殖.,有些病毒对宿主和感染组织有严格的选择性，另一些则选择不严，除少数外，大都能在实验动物、鸡胚或细胞培养中生长。,事实上要对病毒进行详细的研究，最好它能在细胞培养中生长繁殖。,一、实验动物,1、使用实验动物的必要性,病毒的致病力测定，致病机理和免疫应答试验非用实验动物不可。例如新城疫病毒的毒力测定常用1日龄雏鸡作脑内接种，或者静脉接种6周龄小鸡，观察其发病和死亡情况。,一种疫苗的效力试验，更需将其接种于免疫对象作检验。,在病毒病的诊断中大量应用血清学试验，而特异性抗血清常用兔或其他适宜的实验动物生产的。因此用实验动物培养病毒的方法虽古老，但还有一定的重要性,。,2、对实验动物的要求,实验动物首先要对待检病毒有易感性，如果病毒对宿主的选择性很严格，有时不得不应用天然宿主，如猪瘟病毒必须接种猪。,实验动物必须健康无病，不能有其他病毒的隐性感染，必须不曾天然或人工接触过待检病毒.,有特异性免疫力的动物是不适用于试验的,为了保证试验的成功进行，最好选用SPF动物。,如果无法获得这些动物，一般选用幼小动物，如乳鼠等。,3、使用实验动物的优缺点：,实验动物接种不需昂贵的设备，技术简单，而且容易获得成功。缺点是合乎要求的动物不易获得，动物个体差异较大，结果判定比较困难，费用较大，特别是大动物，数量也有限，需要隔离畜舍，良好的饲养管理和消毒设备。,4、实验动物的接种部位,：,动物试验时根据病毒种类接种于静脉、肌肉，皮下，腹腔，脑内，呼吸道，口服等。接种后观察其临床症状，病理变化(肉眼和显微镜)和血清抗体水平等。,二、鸡胚培养,1、,概述,在本世纪,50,年代以前，细胞培养尚未在病毒学中大量应用，许多病毒的主要培养方法是接种于发育中的鸡胚。,鸡胚是一个病毒生长的良好环境，有繁殖快速的胚胎细胞，条件稳定；,外界微生物不易侵入。,此法早在,1931,年,Goodpasture,等用于病毒传代，此后发展迅速，很多病毒能够适应在当时是个了不起的成就。,供接种用的鸡胚必须要求严格，保证不带病毒和其他微生物，鸡胚中没有针对被分离病毒的母源抗体，蛋壳最好为白色以便于检查。为此供蛋母鸡要求健康无病，最好是,SPF,母鸡。,2、使用鸡胚的优缺点：,优点是技术简单，来源方便，价格低廉，不需特殊设备。,如果鸡场管理良好，一般没有细菌污染，无潜伏病毒，也可做到不带母源抗体。,它的缺点是很多病毒不能适应，特别是哺乳动物的病毒。鸡胚中可能携带这样或那样微生物，如禽白血病病毒，霉形体和沙门氏菌等。,3、鸡胚的接种途径,应用最广者为,尿囊腔，绒尿膜和卵黄囊,，偶而接种于羊膜腔，静脉内或脑内。,绒尿膜接种最适用于产生痘斑状病灶的病毒，如禽痘等。,尿囊腔接种适用于流感、新城疫等病毒的分离和传代，它们在尿囊内胚层细胞中生长良好，繁殖的病毒被释放到尿囊液中。制备疫苗或生产大量抗原常用此法。,卵黄囊接种主要用于某些披膜病毒的培养。,羊膜腔接种操作麻烦，不适于大量应用，但有时感染呼吸道的病毒如流感病毒在初次分离时不能适应其他部位，则必须经此途径。,静脉和脑内接种仅用于特殊病毒如蓝舌病毒等的分离。,病毒感染鸡胚的标志因病毒种类而异，主要为,鸡胚的死亡、发育不良、畸形和胚体出血或充血，绒尿膜的水肿、出血、坏死和痘斑病变，尿囊液和羊水等胚液的血凝作用,，或用血清学试验检查其病毒滴度等。,鸡胚接种除了分离病毒外，尚用于某些疫苗的生产，如新城疫苗禽痘疫苗，流感疫苗等。,其他禽类的胚胎如鸭胚和鹅胚也有应用，如小鹅瘟病毒的分离和疫苗生产均须用鹅胚，鸭瘟病毒的分离须用鸭胚接种。,无感染死亡鸡胚,三、细胞培养,1、细胞培养迅速发展的原因,由于蛋白酶(一般用胰蛋白酶)和螯合剂(一般用EDTA钠，又称versene)的应用，使组织细胞分散而不受损伤。,综合营养液的发展，如Eagle氏的MEM、Morgan的199，RPMI1640等常用营养液，国内外均有商品出售，它们营养完全，能满足不同细胞的生长需要，为病毒实验室提供很大方便。,细胞培养的最大障碍是容易被细菌污染，抗生素大大地减少了技术上的困难，使一般实验室在普通条件下都能进行这项工作。,绝大多数病毒都能在细胞培养中生长，许多新病毒都是在细胞培养中发现的，如许多肠道病毒等。当然也有一些病毒不能适应，如绵羊型恶性卡他热病毒，或者生长很困难，如轮状病毒和冠状病毒的某些成员。,2、细胞培养的优点,细胞培养中每个细胞的生理特性基本上是一致的，对病毒的易感性也是相等的。,每瓶细胞培养代表一个实验动物或鸡胚而且有标准的一致性，没有实验动物的个体差异，从而对病毒的生长具有高度准确性和可重复性。,细胞培养本身就能显示病毒的生长特征（如细胞病变），因此很多情况下不需再用其他系统来证实病毒的确实生长。,细胞培养中可以排除特异性抗体或非特异性抑制因子的干扰。,细胞培养技术可以严格执行无菌操作。,在细胞培养中可以进行许多检验项目，如血吸附试验，核酸类型的鉴定，干扰现象，免疫荧光等，在鸡胚或实验动物中就比较困难。,但是细胞培养技术比较复杂，需要反复练习才能熟悉和掌握，使用的药品和器材要求严格。此外不同病毒适应的细胞常各异，有些病毒在细胞培养中要盲传几代才能适应生长。,缺点,3、细胞培养的类型,(1)原代细胞 动物组织经胰蛋白酶消化，使细胞分散而得。各种组织都能制备，最常用者为,肾和睾丸,等，胚胎和幼畜的细胞较易生长。它的优点是病毒对天然宿主的细胞最易感；适宜于病毒的分离。缺点是有时携带潜伏病毒。,(2)二倍体细胞株 原代细胞长成单层后用胰蛋白酶或EDTA钠将细胞从玻面消化下来，使细胞分散。然后加入新营养液，再分装于玻瓶中长成单层。如此可以连续传代，细胞的染色体数与原组织中一样，仍为二倍体，因此称为,二倍体细胞,。它的优点是细胞碎片较少，潜伏病毒容易发现，对病毒的易感性与原代细胞差别不大。二倍体细胞可以大量培养，将多余细胞在液氮罐中贮存，随时取用，甚为方便。,(3)传代细胞系 与上述两类细胞不同，这类细胞可在体外无限制分裂下去，如,HeLa、PK15，Vero，BHK21，IBRS-2,RK-13,等。它们有些从肿瘤组织而来，有些从细胞株转化而来。它们的染色体数目常不正常，称为异倍体。优点是容易培养，生长迅速，随时可以获得。缺点是对病毒分离不够敏感，也不能用此直接制备疫苗，因为接种到动物体内有引起肿瘤的潜在危险。,每种细胞培养系统各有其优缺点，因此在特定条件下选择最满意的系统。,动物细胞培养过程示意图,4、细胞培养的方法,(1).静置培养 这是最常用的一种方法。,(2).转管培养 细胞悬液分装在圆瓶内，培养时玻瓶不断缓慢旋转(510rh)，细胞贴附于玻瓶四周，并长成单层。,(3).悬浮培养 通过不断搅拌使细胞在悬浮条件下培养，并补充营养液和校正pH。此法只能用于某些传代细胞系，而原代细胞和二倍体细胞系在悬浮条件下是不能分裂的。,(4).微载体培养 微载体是微小颗粒，比重稍大于1.0，静置时缓慢下沉，稍加搅动容易飘浮。收获细胞时可将培养瓶静置片刻，使微载体下沉，吸去营养液，加适量胰蛋白酶溶液，使细胞脱落。将液体通过2号垂熔玻璃滤器，收获细胞液，微载体可以重复使用。,常用的细胞培养,5、细胞病变,病毒在细胞内繁殖的结果，常常导致细胞损伤，甚至将其杀死，因而在低倍显微镜下可以看到不同表现的细胞病变,(cytopathic effect，CPE)。,对某种病毒来讲，在细胞培养中CPE的特征固定不变，即使同种病毒在几种不同细胞培养中生长，CPE也常很相象。分类上相近的病毒，CPE常相近似。,由于,CPE甚为稳定，因此能作为病毒鉴定的重要标志之一。,必须指出CPE相似不一定就是属于同类或相近的病毒，反之亦然。另外还有一些病毒在细胞培养中不导致CPE的出现。,CPE大体上可以分为4类：,细胞的折光率增强，形态逐渐变圆，感染细胞由局部扩展到整个单层，细胞死亡，自玻面脱落，如肠道病毒。,细胞聚集成丛，类似葡萄串状，细胞之间常有细丝状细胞间桥连接，细胞变圆或者膨大，如大多数腺病毒。,细胞融合形成多核的巨细胞，称为合胞体，如副粘病毒。,胞浆中有空泡形成，如呼肠孤病毒、SV40等。,细胞培养是否被病毒感染，除了观察CPE外还可用血吸附试验、免疫荧光、干扰现象等检查，对于不引起CPE的病毒来说，这些试验更为重要。,正常细胞,CPE,6、空斑形成,细胞单层在接种病毒后再加一层含营养液的琼脂，这样病毒自感染细胞释出后不悬浮于液体中，只能感染邻近与它接触的细胞，以致感染区由原始病灶向四周扩大，形成类似固体培养基上的菌落。如果在琼脂中含有中性红活体染料，则可看到活的细胞呈淡红色，病毒感染区被杀死的细胞呈淡白色，一般称为空斑或蚀斑,(plaque)。,如果感染细胞未被杀死，形成的空斑颜色可能比正常细胞区更红，此称红色空斑。一个空斑至少是由一个病毒粒子感染细胞的结果，这样病毒的数量可以按空斑数测出。病毒数量正确地说是空斑形成单位(plaque forming unit，PFU)。,空斑形成试验的用途很大，如用于病毒数量的测定，筛选病毒纯系(即克隆，clone)、病毒的鉴定不同病毒的空斑具有不同的特征(如空斑大小和空斑边缘的界线清晰或模糊)等,。,Quantification of viruses,Plaque assay technique for quantification of bacterial viruses.,四、理化学因子对病毒的作用,(一)物理因子,1、温度,病毒在低温下稳定，在高温下易失活。大多数病毒在0C以下良好生存，特别是在干冰温度（-70C）和液氮温度（-196C）下更可长期保持其感染性。相反，大多数病毒于5560C条件下几分钟到十几分钟内灭活，100C可在几秒钟内灭活病毒。,热对病毒的灭活作用主要是使病毒的蛋白质变性。,温度,热对病毒的灭活作用，受周围环境因素的影响。蛋白质以及钙、镁等两价离子的存在可提高某些病毒对热的抵抗力。,蛋白酶和核