生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,*,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,许多,活性蛋白质、多肽,都是由,无活性的蛋白质前体,，经过酶的,加工剪切转化,而来的。,从寻找,新药的角度看,，研究,活性多肽结构与功能,的关系，有助于了解多肽中,哪些氨基酸序列是活性所必需的,，以便以更短的多肽来代替。,用不同的氨基酸去,置换,活性多肽中的有关氨基酸，可以提高其生理活性，减少临床的,不良反应,。,同时，对氨基酸,排列形式立体结构的研究,，有助于设计新的,活性多肽类药物,。,2,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,目前，主要的,多肽类药物,有以下几种：,1、多肽激素,（1）垂体多肽激素,（2）下丘脑激素,（3）甲状腺激素,（4）胰岛激素,（5）胃肠道激素,（6）胸腺激素,3,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2、多肽类细胞生长调节因子,表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。,3、含有多肽成分的其他生化药物,（二）蛋白类药物,蛋白质生化药物除了,蛋白质类激素和细胞生长调节因子,外，还有像,血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂,等大量的其他生化药物品种。,作用方式,也从生化药物对,机体各系统,和,细胞生长的调节,扩展到,被动免疫、替代疗法、抗凝血剂以及蛋白酶的抑制剂,等多种领域。,4,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,自20世纪70年代后期开始，人们首先把目标集中在,应用基因工程技术制造重要的蛋白质药物,上。,现正从,微生物和动物细胞,的表达向,转基因动植物,发展。,鉴于一些蛋白质和多肽生化药物有一定的,抗原性,、,容易失活,、在体内的,半衰期短,、,用药途径,受限等难以克服的缺点。,对一些蛋白质类生化药物进行,结构修饰,、应用,计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用,、发展,蛋白质工程,及设计相对简单的,小分子,来,代替某些大分子蛋白质类药物,并且起到,增强或增加选择性疗效,的作用等。,5,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,主要蛋白质类药物有以下几种1、蛋白质激素,（1）垂体蛋白质激素。,（2）促性腺激素。,（3）胰岛素及其他蛋白质激素 胰岛素、胰抗脂肝素、松弛素、尿抑胃素。,2、血浆蛋白质,3、蛋白质类细胞生长调节因子,4、黏蛋白,5、胶原蛋白,6,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,6、碱性蛋白质,硫酸鱼精蛋白等。,7、蛋白酶抑制剂,胰蛋白酶抑制剂、大豆胰蛋白酶抑制剂等。,8、植物凝集素,二、多肽与蛋白质类药物的制造方法,目前用于,多肽和蛋白质类药物的制造方法,主要有三种：,提取分离纯化法、化学合成法和基因工程法,。这里重点介绍,提取分离纯化法,。,（一）蛋白质与多肽类药物提取、分离纯化,7,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,1材料选择,采用提取分离纯化法获得的多肽及蛋白质类药物，其,原料的主要来源有动植物组织和微生物,等，原则是要选择,富含所需蛋白质多肽成分,的、易于,获得,和易于,提取,的,无害生物材料,。,对,天然蛋白质类药物,，为提高,质量、产量,和降低生产,成本,，对原料的,种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞,都有一定的要求，了解这些，可使,分离纯化工作,事半功倍。,8,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（1）种属,牛胰含胰岛素单位比猪胰高。,抗原性,则,猪胰岛素比牛胰岛素,低，前者与人胰岛素相比，只有,1个氨基酸,的差异，而牛有,3个氨基酸,的差异。,由于,种属特异性的关系,，用猪垂体制造的,生长素,对人体无效，不能用于人体。,由动物细胞产生的,干扰素与人干扰素抗原有交叉反应,，而对一些,非同源性动物,的某些细胞,抗病毒活性,作用并不下降。,9,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（2）发育生长阶段,幼年动物的,胸腺比较发达,，老龄后逐渐萎缩，因此,胸腺原料,必须采用,幼龄动物,。,HCG,在妊娠妇女,6070d,的尿中达到高峰，到妊娠18周已降到最低水平。然而,HMG,必须从,绝经期,的妇女尿中获取。,肝细胞生长因子,是从,肝细胞分化最旺盛阶段的胎猪或胎牛肝,中获得的，若用成年动物，必须经过,肝脏部分切除手术,后，才能获得,富含肝细胞生长因子,的原料。,3）生物状态,动物饱食后宰杀,，胰脏中的,胰岛素含量增加,，对提取胰岛素有利，但,胆囊收缩素,的分泌使,胆汁排空,，对胆汁的,收集不利,。,10,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（4）原料来源,血管舒缓素,可分别从,猪胰脏和猪颚下腺,中提取，两者生物学功能并无二致，而稳定性以,颚下腺,来源为好，因其不含,蛋白水解酶,。,（5）原料解剖学部位,猪胰脏中，,胰尾部分,含,激素,较多，而,胰头部分,含,消化酶,较多，如分别摘取则可提高各产品的收率：,胃膜素,以采取,全胃黏膜,为好，,胃蛋白酶,则以采取,胃底部黏膜,为好，因胃底部黏膜富含,消化腺,。,11,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2提取,提取的总要求是,最大限度,地把有效成分提取出来，关键是,溶剂的选择,。,提取所用溶剂的,选择标准,，首先对被制备物具有,最大溶解度,，并在提取中尽可能,减少一些不必要的成分,。,为了更好地达到以上两个目的，常用的手段是调整溶剂的,pH、离子强度、溶剂成分配比和温度范围,等。,12,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,3、分离纯化,多肽及蛋白质,的分离纯化是将提取液中的目的蛋白质与其他,非蛋白质杂质及各种不同蛋白质分离开来,的过程，常用的,分离纯化方法,有：,（1）根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质,蛋白质、多肽及氨基酸都是,两性电解质,。其净电荷为零，此时环境的pH即为该蛋白质的,等电点,。,在等电点时蛋白质,性质比较稳定,，其物理性质如,导电性、溶解度、黏度、渗透压,等皆最小，因此可利用蛋白质,等电点时溶解度最小的特性,来制备或,沉淀蛋白质,。,13,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,两性物质的等电点会因条件不同,（如在,不同离子强度,的不同缓冲溶液中，或,含有一定有机溶媒,的溶液中）,而改变,。,蛋白质在介质中的,等电点,是和介质中,其他成分的存在,有关系的。,用,等电点法沉淀,蛋白质常需,配合盐析操作,，而除去不需要的杂蛋白时，常需,配合热变性操作,。,等电聚焦电泳,除了用于分离蛋白质外，也可用于,测定蛋白质的等电点,。,14,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（2）根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质,蛋白质的一个主要特点是,分子大,，而且不同种类的蛋白质分子,大小也不相同,。由此可以用,凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法,等将蛋白质与其他小分子物质分离，也可将大小不同的蛋白质分离。,用,超滤法,时，超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有,呈线性溶质或者是球形溶质的区别,，可能出现不同的结果。,葡聚糖凝胶,含有,少量的酸性基团,，故有,较弱的离子交换作用,，此外还有,吸附作用,。可采用,低浓度的盐溶液,，或者用与待分离蛋白质相同的标准蛋白质,预先使凝胶柱平衡,，以期不损失所分离的蛋白质。,15,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（3）根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质,蛋白质的溶解度,受溶液的,pH、离子强度、溶剂的电解质性质及温度,等多种因素的影响。适当改变外界条件，可以有选择地,控制某一种蛋白质的溶解度,，达到分离的目的。,属于这一类的分离方法有,蛋白质的盐溶与盐析法、结晶法和低温有机溶剂沉淀法,。,乙醇和丙酮,是有机溶剂沉淀法中最常用的有机溶剂，,由于丙酮的介电常数小于乙醇,，故丙酮沉淀能力比乙醇强。,根据实践，,乙醇沉淀的物质，改用丙酮可减少l0左右,。,16,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（4）根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质,离子交换剂,作为一种固定相，本身具有正离子或负离子基团它对溶液中,不同的带电物质,呈现不同的,亲和力,，从而使这些物质,分离提纯,。,对蛋白质的离子交换层析，一般多用,离子交换纤维素或以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂,。主要是取其有较大的蛋白质,吸附容量,、较高的,流速,和,分辨率,等优点。,可按不同情况选择离子交换条件：,如果,吸附得太牢,，可改用,交换当量,较小的交换剂，或改变条件,降低交换剂上带电基团的解离度,。,17,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（5）根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质,主要的手段是,亲和层析法,，即利用蛋白质分子能与其相应的,配体,进行,特异的、非共阶键的可逆性结合,而达到,纯化的目的,。,用亲和层析纯化某种蛋白质，有时并不能取得预期的效果。原因之一就,是非专一性吸附问题,，非专一地吸附一些,无关的蛋白质,而与,专一吸附的蛋白质,相混杂，影响了分离效果。,非专一性吸附主要来自吸附剂上的,离子基团和疏水基团,。,固相化金属亲和层析（IMAC）,蛋白质分子中的,咪唑基和巯基,可与一些金属元素形成,配位结合,。,18,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（6）根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质,蛋白质分子上有疏水区，这些疏水区，能够与,吸附剂,上的,疏水基团结合,，再通过降低介质的离子强度和极性，或用含有去,垢剂的溶剂,，提高,洗脱剂,的pH等方法将蛋白质洗脱下来。,（7）根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质,这是一种以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程，称之为,逆流分溶，利用逆流分溶技术分离,垂体,激素、氨基酸、DNA,是很有效的。,19,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（8）根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质,在蛋白质分离中，最广泛使用的吸附剂有,结晶磷酸钙（羟灰石）,、,磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭,等。,（9）根据蛋白质的某些特殊性质进行纯化,如：,白蛋白,在弱酸性条件下加,辛酸钠,可,耐受67的温度,，而其他蛋白质将变性。,球蛋白,或白蛋白在碱性条件下，可以和,利凡诺作用,，,形成络合物,而与其他,蛋白质分离,。,细胞色素C和胰岛素,可用一定浓度的蛋白沉淀剂如,三氯醋酸沉淀,，而保存其活力。,又如：,酶蛋白超氧化物岐化酶（SOD）,能抵抗,蛋白水解酶,的水解，因而可用,蛋白水解酶,降解其他蛋白质，以便于,SOD进一步的纯化,。,20,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,4、分离纯化方法的选择,分离纯化,是整个生化制备过程的,核心部分,。,对于某一物质，究竟选用什么分离纯化方法最理想，主要是根据该物质的,物理化学性质和具体实验条件而定,。认真参考,借鉴前人经验,可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。,即使是分离一个,新的未知组分,，通过,分析预试验,的,初步结果,，参考别人对,类似物质分离纯化经验,，也可以帮助少走些弯路。,21,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,5、溶液中蛋白质浓度的测定,在蛋白质,分离纯化,过程中，,蛋白质浓度的测定,是不可缺少的手段。溶液中蛋白质的浓度可根据它们的,物理、化学性质，如折射率、相对密度、紫外光吸收来测定,；,可用,化学反应方法,，方法中，,紫外吸收法、双缩脲法、福林酚试剂法、考马斯亮蓝染色法,最为常见，它们操作简单，不需要昂贵的设备。,以下主要介绍这几种方法。,22,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（1）紫外吸收法,280nm光吸收法。,在280nm处测定光吸收值。通常以浓度是,1mg蛋白质ml溶液的A,280,为,1.0,进行估算。若已知该蛋白质的,文献值,，可直接计算出样品溶液中蛋白质的浓度。,280nm和260nm的吸收差法,。若样品中含有,嘌呤、嘧啶等吸收紫外光,的,核酸类物质,，在用,A,280,来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。,由于核酸在260nm的光吸收比280nm更强,，因此可利用280nm及260nm的吸收差来计算蛋白质的浓度。,2l5nm和225nm的吸收差法,蛋白质的肽键在,200250nm有强的紫外光吸收,，用,215nm 和225nm光吸收差值,。,减少非蛋白质成分引起的误差,。,23,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（2）双缩脲法,常量双缩脲法,。蛋白质含有多个,肽键,、因此有,双缩脲反应,。在碱性溶液中,蛋白质与铜离子,形成,紫红色化合物,、可在,540nm处比色测定,。,微量双缩脲法。,由于,铜与蛋白质复合物,的最大吸收峰在,260280nm,。在,310330nm,测定干扰因素少一些，因此。选用,310nm进行比色测定,。,（3）福林酚试剂法,本方法首先在碱性溶液中形成,铜与蛋白质复合物,，然后该复合物中的,酪氨酸和色氨酸残基,还原,磷钼酸磷钨酸试剂（福林试剂）,，产生,深蓝色,。本法可用,750nm比色测定，或500nm比色测定,，本法的标准曲线,线性较差,，样品浓度需,按标准曲线校正,。,24,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（4）考马斯亮蓝G 250染色法,考马斯亮蓝G 250,在酸性溶液中为,棕红色,，当它与蛋白质通过,疏水作用,结合后，变为,蓝色,，,可在595nm比色测定,。但不同蛋白质之间的差异较大，且标准曲线,线性较差,。,25,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,6、纯度检查,蛋白质的纯度是,化学和物理学的概念,，蛋白质的,聚合状态、辅基的存在、蛋白质的变性作用,等极大地影响其,生物活性,，而这些因素的影响往往是用,一般纯度检查的方法所查不出来的,，这是值得注意的一种情况。,常用蛋白质纯度检查的方法有：,26,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（1）HPLC 或FPLC,这是,蛋白质纯度检查,常用的有效方法美国药典已规定把HPLC用于胰岛素纯度的检测项目中。,（2）电泳法,凝胶电泳,呈现单一区带，是纯度的一个重要指标，说明样品的,荷质比（电荷质量）,是均一的。如果在,不同的pH下,进行凝胶电泳都是一条区带，则结果更加可靠。,27,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（3）免疫化学法,主要有,免疫扩散、免疫电泳、双向免疫电泳扩散、放射免疫分析、酶标免疫分析,等。此法适用于能产生,特异性抗体的蛋白质,，无论是检查所需要的或者是被污染的蛋白质都适用。,（4）生物测定法,利用动物体或动物的,离体器官,、细胞进行,生物效价的测定,，这种方法接近动物临床所产生的生物学效应，因此,实际意义也更大,。,28,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（5）分光光度法,紫外分光光度法。,不同的蛋白质在紫外区的吸收峰有微小的差别。由于其,特异性,，可作为,定性或定量,测定的参考。,红外分光光度法。,由于蛋白质的,分子结构有一定的能级,而有别于其他,非蛋白质物质,，故红外光谱为人们提供了,“分子指纹”,。,29,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（二）多肽与蛋白质的化学合成,多肽的合成是20世纪50年代开始获得重大发展的。多肽的全合成不仅具有很重要的,理论意义,，而且具有重要的,应用价值,。,通过多肽全合成可以,验证一个新的多肽的结构,；,设计新的多肽,，用于,研究结构与功能,的关系；为多肽,生物合成反应机制,提供重要信息；同时也是多肽药物制备的,有效方法,。,多肽合成一般从,C端（羧基端）向N端（氨基端）,进行。,30,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,早期的,多肽合成,是在溶液中进行的，称为,液相合成法,。现在多采用,固相合成法,，与液相法相比，,固相法,大大地降低了每步产品,提纯的难度,。,近几十年来，固相法合成多肽以其,省时、省力、省料,、便于计算机控制、便于普及推广的优势而成为多肽与蛋白质合成中的一个,常用技术,。,应该指出的是人们还只能合成一些较短的肽链，对于合成蛋白质还有诸多的困难，而在生物体内，,核糖体,上合成肽链的,速度和产率,都是惊人的。,那么，是否能从,生物体合成蛋白质的原理,上得到一些启发，应用在多肽合成上，这是一个令人感兴趣的问题，也许是今后,多肽合成的发展方向,。,31,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,对于多肽合成一般,需要以下几个主要步骤,：,氨基保护和羧基活化；羧基保护和氨基活化；接肽和除去保护基团,。,1、基团保护,要实现控制多肽合成，必须做到事先把不应与,接肽反应试剂,发生作用的,官能团,，如,N末端,氨基酸残基的,自由,NH,2,、,C末端,氨基酸残基的,自由COOH,以及,侧链上的一些活泼基团，特别是SH,等，,加以封闭或保护,。待肽链形成之后，再将,保护基除去,。,作为,保护基,，必须既能在接肽时起到,保护作用,，而在,接肽,以后，又能很容易地除去，且不致引起,肽链的断裂。,32,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,常用的,氨基保护剂,有,苄氧羰基,（需要用,较强的酸解,条件才能脱除）、,叔丁氧羰基（Boc,，可用,三氟乙酸TFA,脱除）和,9芴甲氧羰基（Fmoc,，可用哌啶 CH,2,Cl,2,，或,哌啶DMF,脱除），其中Fmoc最常用。,羧基的保护,通常是用,无水乙醇或甲醇,在盐酸存在下进行,酯化,，,使羧基接上烷基,。除去保护基可在常温下用,氢氧化钠皂化法,。,其他功能基团,，例如组氨酸的,咪唑基,、丝氨酸的,羟基,、酪氨酸的,酚基,、半胱氨酸的,巯基,等，都可用,苄基（Bz）保护,，用,钠氨法除去,。,谷氨酸和天门冬氨酸的及,羧基,可用,及苯甲酯保护,，用,催化氢化法,除去。精氨酸的,胍基,用,对甲基磺酰基（Tos）保护。,33,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2、肽的液相合成法,接肽反应除用,缩合剂合成,外，还可以用分别,活化参与形成肽链的氨基和羧基,的方法来完成。因,活化氨基的反应激烈,，而且常常,产生消旋化,，所以，总是采用,羧基活化的方法,，也就是说，,合成肽的常规方法是从C端向N端进行,。,肽的合成法可分为,阶梯伸长法和片断缩合法,。,阶梯伸长法是,合成比较小的肽或肽段,常采用的方法：,片断缩合法,是由小肽缩合成大肽的方法，为了,避免消旋,，常用,叠氮法接肽,。,34,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,3、肽的固相合成法,1963年，RBMerrifield创立了将氨基酸的,C末端固定,在,不溶性树脂,上，然后在此树脂上依次,缩合氨基酸,、延长肽链 合成蛋白质的固相合成法 在固相法中，每步反应只需简单地洗涤树脂，便可达到纯化目的，为,自动化合成肽奠定基础,。,今天，固相法得到了很大发展。除了Merrifield所建立的用,Boc（叔丁氧羰基）保护氨基,的,Boc固相合成法,之外，又发展了,氨基,用Fmoc（9芴甲氧羰基）保护的,Fmoc固相合成法,。,35,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,36,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,在,B,o,c,合成法,中，,反复地用酸来脱保护,。这种处理带来了一些问题。如在肽与树脂的接头处，当每次用,50TFA（三氟乙酸）脱Boc基,时。有约,14的肽,从树脂上脱落，此外，,酸催化会引起侧链的一些副反应,。,Boc合成法,尤其不适于合成,含有色氨酸等对酸不稳定的肽类。,1978年，报道的,Fmoc（9芴甲氧羰基）基团作为氨基保护基,，成功地进行了多肽的,Fmoc固相合成。,Fmoc法与Boc法的,根本区别,在于采用了,碱可脱除的Fmoc,为氮基的保护基。,37,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,4、合成肽链的纯化,多肽合成,以后，由于在介质中存在着副产物，因此仍然有,分离、纯化的问题,，但这比在天然原料中进行纯化要方便得多蛋白质分离纯化的一般技术手段都可以,酌情配合使用,，如结晶法、超滤法、高效液相色谱、亲和层析等。,（三）基因工程法,自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程技术且目前,最为活跃的研究领域,便是医药科学。,基因工程技术的迅猛发展使人们已能够十分方便有效地生产许多以往从,自然界很难或不能大量获取的蛋白质,，甚至可以创造出自然界中不存在的,全新物质,。,38,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,基因工程蛋白质药物的生产是一项十分复杂的系统工程。,可分为,上游和下游两个阶段,。,上游阶段,是研究开发必不可少的基础，它主要是,分离目的基因,、,构建工程菌（细胞）,。,下游阶段,是从工程菌（细胞）的大规模培养一直到产品的,分离纯化、质量控制,等。,下游阶段主要包括,工程菌大规模发酵最佳参数的确立、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制,等。,39,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,工程菌的发酵工艺,不同于传统的抗生素和氨基酸发酵，,需要对,影响目的基因表达的因素进行分析,，对各种,影响因素进行优化,，建立适于,目的基因高效表达,的,发酵工艺,，以便获得较高产量的目的基因表达产物。,为了获得,合格的目的产物,，必须建立起系列相应的,分离纯化、质量控制、产品保存等技术,。40,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,三、重要的多肽与蛋白质类药物的制备,（一）多肽类药物,1、胸腺激素,胸腺,是一个,激素分泌器官,，对免疫功能有多方面的影响。,胸腺依赖性的淋巴细胞群T细胞,直接参与有关免疫反应。胸腺对,T细胞发育,的控制，主要通过由胸腺所产生的,一系列胸腺激素,，促使T细胞的,前身细胞,分化、增殖、成熟,为T细胞的各种功能亚群，由此控制调节免疫反应的,质与量,。,现已知某些免疫病变等皆与,胸腺功能的减退及血中胸腺激素水平的降低,有关。,41,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（1）胸腺素,胸腺激素制剂,总的说来，都与,调节免疫功能有关,。,在所有胸腺激素制剂中，对来自小牛胸腺的,胸腺素组分5,（即以小牛胸腺为原料，按一定的方法提取、纯化胸腺的,第5种组分,）的基础理论和临床研究最多。,结构和性质：胸腺素组分5,是由在,80热稳定,的,4050种多肽,组成的混合物，,分子量在100015000,之间，,等电点在3.59.5之间,。,42,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,根据它们的,等电点,以及在等电聚焦分离时的顺序，共分,三个区域,：,区,包括,等电点低于5.0的组分,，,区,包括等电点在,5.07.0之间,的组分，,区,则指其等电点在,7.0以上者,（此区内组分很少）。,对分离的,多肽,进行免疫活性测定，,有活性的称为胸腺素,，,无活性者则称之为多肽,。,现已清楚，,胸腺素组分5,中，胸腺素,1,、,5,、,7,、,3,和,4,等是具有,调节胸腺依赖性淋巴细胞分化和体内免疫反应,的活性组分。,43,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,工艺路线,44,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,工艺过程,提取 匀浆、离心,加热去杂蛋白,提取液,80加热15min,，,沉淀,-,10丙酮,，,超滤,取分子量在,15000以下,的超滤液,。,脱盐、干燥,超滤液经,Sephadex G-25脱盐,后，,冷冻干燥,得,胸腺素,。,（,3）检验方法：,活力测定：,E-玫瑰花结升高,百分数不得低于,10,；分子量15000以下。,（4）作用与用途：,为,免疫调节剂,。,45,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2、胸腺肽（Thymus peptides）,（1）结构和性质,：胸腺肽中主要是,分子量9600,和,7000,左右,的两类蛋白质或肽类，还含有RNA 0.20.3mgmg，DNA 0.120.18mgmg。,对热较稳定,，,加温80生物活性不降低,。经,蛋白水解酶,作用，生物,活性消失,。,（2）生产工艺：,工艺路线,46,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,工艺过程,超滤、提纯、分装、冻干 加3甘露醇作赋形剂,。,（3）检验方法,：活力测定同胸腺素。,分子量10000,以下。,（,4）作用与用途,：胸腺肽可,调节细胞免疫功能,，有较好的抗衰老和抗病毒作用,。,无过敏反应和不良的副作用,。,47,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2、降钙素,（1）结构和性质,降钙素,是一种调节血钙浓度的,多肽激素,，由甲状腺内的,滤泡旁细胞（C细胞）分泌,或,鱼、鸟,等其他脊椎动物的,后腮腺分泌,。,是由,32个氨基酸残基,组成的单链多肽，,N 端为半胱氨酸,，它与,7位上的半胱氨酸间形成二硫键,，,C端为脯氨酸,。如果,去掉脯氨酸,，生物活性,完全丧失,。,降钙素,分子量约为3500,，溶于,水和碱性溶液,，不溶于,丙酮、乙醇、三氯甲烷、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳,等，,难溶于有机酸,。25以上避光保存可,稳定两年,，,水溶液于210可保存7d,。,48,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,降钙素,广泛存在于多种动物体内，在人及哺乳动物体内主要存在于,甲状腺、甲状旁腺、胸腺和肾上腺,等组织中，鱼类则在,鲑、鳗、鳟等的终鳃体,里含量较多。,由,鲑鱼,中获得的降钙素对人的,降钙作用,比,其他哺乳动物中分离出的降钙素要,高,25,50,倍,，,各种不同动物来源的降钙素，其氨基酸排列顺序有些差异,。,（2）生产工艺,制造降钙素的原料主要有,猪甲状腺,和,鲑、鳗,的心脏或心包膜。下面介绍基因工程技术生产降钙素的工艺。,工艺路线：,49,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,鲑鱼降钙素甘氨酸（sCTGly）,基因的获取,采用,人工合成DNA序列,的办法，合成含有鲑鱼降钙素基因的DNA序列，基因的设计选用大肠杆菌,偏爱密码子,。,在基因的两端引入,Sau3A酶切位点,，以便于基因插入到,克隆及表达载体中,。在基因的3端CT基因后加入一个,甘氨酸密码子和一个终止密码,，加入,甘氨酸密码子,可使CT基因表达产物在,C末端酰化酶,（CAB）作用下,C末端羧基转化成酰胺,，以获得生物活性降钙素，加入终止密码使,翻译终止,。,在,5端CT基因后,加入一个,蛋氨酸,以便使用,BrCN,对融合蛋白进行化学切割，从而,分离Sct Gly,。,50,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,51,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,产物纯化,采用 Amberchrom CG300M离子交换柱，去除未反应的,SO,3,sCT,和,SO,3,sCT Gly,等物质。洗脱液冻干得,sCT粉末,。,（3）检验方法,生物活性测定方法,：血样品的,血清钙,值采用,原子吸收光谱法测定,。根据,标准品,测定样品的生物活性：,由第一次世界卫生组织专业会议确定的,降钙素标准品,为,猪2000Umg、鲑2700Umg,。,52,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（4）作用与用途,降钙素的主要功能是降低血钙,。由于降钙素有,抑制破骨细胞活力,的作用，所以能抑制骨盐的溶解吸收，从而,阻止钙从骨中释出,。,血钙高,可促使,降钙素,分泌增加，使血钙降低，,血钙低,时可促使,甲状旁腺素,分泌增加而,使血钙升高,，两者互相制约，,共同维持血钙平衡,。,53,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（二）蛋白质类药物,1、胰岛素,胰岛素是世界上第一个,人工合成的蛋白质,。,胰岛素,广泛存在于,人和动物的胰脏中,，正常人的胰脏约含有200万个胰岛。,胰岛由、和三种细胞组成,，其中,细胞,制造,胰岛素,，,细胞,制造,胰高血糖素和胰抗脂肝素,，,细胞,制造,生长激素抑制因子,。,胰岛素,在细胞中开始时是以活性很弱的,前体胰岛素原,存在的，进而,分解为胰岛素,进入血液循环。,54,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（1）结构和性质,胰岛素由,51个氨基酸组成,，有,A和B两条链,，A链含,21个氨基酸,残基，B链含,30个氨基酸,残基，两链之间由,两个二硫键相连,，A链本身还有,一个二硫键,。,不同种属动物,的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在,A链二硫桥,中间的第,8、9和10位,上的三个氨基酸及,B链C末端,的一个氨基酸上。,它们,随种属而异,。但它们的,生理功能是相同的,。,55,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,56,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,57,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,59,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,说明和讨论,原料质量和预处理问题,工业生产用的原料主要是,猪、牛的胰脏,。采摘胰脏要注意,保持腺体组织的完整，避免摘断,。由于胰脏中含有,多种酶类,，离体后，,蛋白水解酶,类能分解胰岛素使之,失活,。因此，,要立即深冻,，先在,30以下,急冻后转入,20保存备用,，如用液氮或干冰速冻，效果更好。,浓缩 近年来，对改进浓缩设各研究须采用,离心薄膜蒸发器,，在第一次浓缩后，浓缩液用,有机溶媒去脂,，再进行第二次浓缩，浓缩溶液,受热时间极短,，避免了胰岛素效价的损失。,60,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,产品纯度 在常规的,结晶胰岛素,中，纯度还是不够的。除了胰岛素主成分外，尚含有其他一些,杂蛋白抗原成分,。,美、英药典主要,控制两个指标,，即,分子量大于胰岛素的蛋白质和胰岛素原,。我国常规生产的胰岛素结晶中,胰岛素原含量约为20000ppm,，而国外一般要求,胰岛素原和脱酰胺胰岛素,含量应为,10ppm和1000ppm,以下，因此还有一定差距。,用,超细Sephadex G50凝胶,过滤，可使结晶胰岛素进一步纯化。,61,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,利用重组DNA技术生产人胰岛素,利用重组DNA技术生产人胰岛素已获得成功，目前采用基因工程技术制备人胰岛素有,AB链合成法和反转录酶法,两条途径。,AB链合成法,以人工合成的人胰岛素A链和B链基因，分别插入克隆载体质粒所携带的,半乳糖苷酶基因,中，再将,重组质粒,导入大肠杆菌，在细胞中进行复制。,并在,半乳糖苷酶基因的信号序列,的控制下，合成mRNA,，再翻译出A链和B链蛋白，用,溴化氰（CNBr）,将A链和B链联接起来组成人胰岛素。,62,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,63,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,反转录酶法,通过,胰岛素原,的,cDNA,合成人胰岛素 先将mRNA经反转录酶处理合成cDNA，用化学合成法把,甲硫氨酸密码子（ATG）,接在,胰岛素原cDNA的5末端,，再将此基因,插入pBR322质粒,载体并转入大肠杆菌中增殖，连接物,蛋氨酸,使胰岛素原从融合的蛋白中释放出来。,胰岛素原,折叠成三维结构，并形成二硫键，,再经工具酶切开，除去C肽,，即可获得,人胰岛素,。,64,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,65,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（3）胰岛素制剂及结构修饰,现有,胰岛素制剂,按其作用时间大致可分,速效、中效、延效,三种类型。在研究胰岛素的,结构与功能关系,的基础上，对胰岛素分子进行了,修饰和改造,，以改变某些性质，如提高,降血糖能力,，延长,体内半衰期,，同时具有,抗热变性,，抗,蛋白水解酶的降解,等特点。,（4）检验方法,胰岛素效价测定：,各国药典规定有,家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法,。,（5）作用与用途,胰岛素是调节血糖水平的重要激素，能使血糖降低。,66,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,2、胰蛋白酶抑制剂,胰蛋白酶抑制剂,是一种小分子蛋白质。已经证实，从,牛胰肺、颌下腺,等组织中提取的,激肽释放酶,。它对蛋白酶具有,广谱抑制作用,。,（1）化学组成的性质,Kunitz胰蛋白酶抑制剂,的相对分子,质量为6200,，是由58个氨基酸残基组成的,碱性多肽,。,活性中心为赖氨酸,，位于分子的顶端。,Kunitz胰蛋白酶抑制剂在,pH 1.1和l0.5时,，以单体占优势，在,中性pH时以二聚体占优势,。,67,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,Kunitz胰蛋白酶抑制剂对,高温、酸、碱和酶,都很稳定，呈白色或类白色粉末，无臭，,溶于水、70甲醇、70乙醇和50丙酮,，有可透析性，,等电点为l010.5,。,Kunitz胰蛋白酶抑制剂可从牛,肺、胰等脏器,中分离提取，或从牛胰提取胰蛋白酶的,结晶母液,、提取胰岛素后的,胰渣中,制得。,68,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（,2）生产工艺,以牛肺为原料的提取法,工艺路线：,69,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,以人尿为原料的提取法,人,尿胰蛋白酶抑制剂,不同于牛肺、胰提取的胰蛋白酶抑制剂。对人体不产生,抗原抗体反应,，更适于临床。,硅酸铝类吸附剂 ployerde,70,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（六）绒膜促性激素（HCG）,1、结构和性质:,HCG是一种,糖蛋白,，由-链和-链两个亚基100个氨基酸组成，,分子量,4700059000,。其核心部分由氨基酸组成，,以共价键与寡糖链相结合,，在糖链的末端带一负电的,唾液酸,，每个HCG分子中约含,20个分子的唾液酸,。,71,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,易溶于水，不溶于,乙醇,、,乙醚和丙酮,等有机溶剂,，,等电点,pI3.23.3,。干品稳定，,稀溶液不稳定,。,2、生产工艺,（1）工艺路线：,72,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,（2）工艺过程：,苯甲酸乙醇饱和液,，用,95乙醇,全部溶解苯甲酸洗脱，HCG沉淀。,离子交换层析,梯度洗脱（PH）30004 000IUmg,羟基磷灰石柱层析,1000012 000IUmg,3、检验方法,检测,HCG生物活性,，中国药典和美国药典均规定使用小白鼠,子宫增重法,，日本药典规定使用大白鼠,卵巢增重法,。中国药典规定1500Umg，第二国际标准品1000015000Umg。,4、作用与用途,73,生化药物制造工艺多肽和蛋白质类药物,