微生物与现代发酵工业.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 微生物与现代发酵工业,生工学院,为什么要利用微生物？,微生物繁殖非常迅速,微生物培养易于控制,微生物本身也容易改造,发酵工程,发酵工程,发酵工程,酒精,有机溶剂,：如乙醇、丙酮、丁醇、甘油；,有机酸,：如醋酸、乳酸、葡萄糖酸、柠檬酸、酒石酸、衣康酸、长链二元酸（以十三到十八碳的直链烷烃为原料的发酵产品）；,氨基酸,：如谷氨酸（单谷氨酸钠又称味精）、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苏氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等；,核苷酸及其类似物,：如鸟嘌呤核苷酸（5-GMP）、肌苷酸（5-IMP）、腺嘌呤核苷酸（5-AMP）、黄嘌呤核苷酸（5-XMP）等；,酶,：目前世界上有100多种酶用微生物发酵生产，应用于不同领域。,单细胞蛋白,酒精发酵是酿酒工业的基础，它与酿造白酒，果酒，啤酒以及酒精的生产等有密切关系。进行酒精发酵的微生物主要是酵母菌，如啤酒酵母(,Saccharomyces cerevisiae,)等，,此外还有少数细菌如发酵单胞菌(,Zymononas mobilis,)，嗜糖假单胞菌(,Pseudomonas Saccharophila,)，解淀粉欧文氏菌(,Eruinia amylovora,)等也能进行酒精发酵。,酵母菌进行乙醇发酵时，根据控制的发酵条件不同，形成的发酵产物有根本的差别，我们将酵母菌的乙醇发酵分为三型：第一型发酵，第二型和第三型发酵。,第一型发酵：,酵母菌在无氧条件下，将葡萄糖经EMP途径分解为2分子丙酮酸，然后在酒精发酵的关键酶丙酮酸脱羧酶的作用下脱羧生成乙醛和CO,2,，最后乙醛被还原为乙醇。,2CH,3,COCOOH,2CO,2,(EMP途径)2CH,3,CHO,NADH,2,NAD,C,6,H,12,O,6,2CH,3,CH,2,OH,总反应式：C,6,H,12,O,6,+2ADP+2Pi 2 CH,3,CH,2,OH+2CO,2,+2ATP,第二型发酵：,是在发酵过程中加入亚硫酸氢钠，亚硫酸氢钠和乙醛起加成作用生成难溶的结晶状亚硫酸氢钠加成物磺化羟乙醛：,OH,NaHSO,3,+CH,3,CHO CH,3,-C-OH,OS,2,Na,由于乙醛和亚硫氢钠发生了加成作用，致使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体生成,-磷酸甘油：,CH,2,OH CH,2,OH,C=O +NADH,2,HCOH +NAD,CH,2,OPO,3,H CH,2,OPO,3,H,2,-磷酸甘油在-磷酸甘油磷酸酯酶催化下去磷酸而生成甘油。,总反应式为：,C,6,H,12,O,6,+NaHSO,3,甘油+磺化羟乙醛,第三型发酵：,是在发酵过程中，控制发酵液出在碱性条件，在碱性条件下进行使乙醛不能作为正常的受氢体，而是两分子乙醛之间发生歧化反应，即相互进行氧化还原反应，一分子乙醛被氧化成乙酸，另一分子乙醛被还原为乙醇：,CH,3,CHO CH,3,CHO,H,2,O NADH,2,NAD,CH,3,COOH CH,3,CH,2,OH,这样又迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体而最终形成甘油。总反应式为：,2C,6,H,12,O,6,2甘油乙酸乙醇2 CO,2,1、酒精发酵原料,(一)淀粉质原料,淀粉质原料是生产酒精的主要原料。我国发酵酒精的80%是用淀粉质原料生产的，其中以甘薯干等薯类为原料的约占45%，玉米等谷物为原料的约占35%。,薯类原料红薯是我国生产酒精的主要薯类原料，也,叫地瓜、山芋、蕃薯，新鲜或制成薯干。其固形物主要成分是淀粉，还含有少量的糖类和蛋白质。,谷物原料(粮食原料)：包括玉米、小麦、高梁、大米等。,（二）糖质原料,常用的糖质原料有糖蜜、甘蔗、甜菜和甜高梁等。,糖蜜又称废糖蜜，它是甘蔗或甜菜糖厂制糖过程中形成的一种副产物，分别称为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜，其产量分别为加工甘蔗和甜菜间的30%左右和3.5%5%。糖蜜含糖量较高，一级甘蔗糖蜜含糖分50%以上，甜菜糖蜜含糖量50%左右，所含主要成分为蔗糖。,甘蔗汁进行酒精发酵。甘蔗法中可发酵固形物包括蔗糖、淀粉及其他碳水化合物。,过剩的甜菜或受冻、变质的甜菜生产酒精。甜菜所含主要糖分是蔗糖。此外还含少量其他碳水合物和果胶质。,甜高粱秆中含糖分10%12%，所结的高粱米富含淀粉，均可用于发酵酒精，是具有潜在发展前途的糖质原料。,（三）纤维质原料,纤维类物质是自然界中的可再生资源。,天然纤维原料由纤维素、半纤维素和木质素三大成分组成，它们均较难被降解。,近年来，纤维素和半纤维素生产酒精的研究有了突破性的进展，纤维素和半纤维已成为很有潜力的酒精生产原料。,农作物纤维质下脚料(稻草、麦草、玉米秆、玉米芯、花生壳、稻壳、棉籽壳等),森林和木材加工工业的下脚料(树枝、木屑等),工厂纤维素和半纤维素下脚料(甘蔗渣、废甜菜丝、废纸浆等),城市废纤维垃圾等。,（四）其他原料,主要指亚硫酸盐纸浆废液、甘薯和马铃薯淀粉渣、各种野生植物和乳清等。用这些原料生产酒精目前还不多见。,2、与酒精发酵有关的微生物,(一)糖化菌,糖化：淀粉质原料全部或部分转化成葡萄糖等可发酵性糖，所用催化剂称为糖化剂。,糖化剂可以是由微生物制成的糖化曲,(,包括固体曲和液体曲,),，也可以是商品酶制剂。无机酸也可以起糖化剂作用，但酒精生产中一般不采用酸糖化,(一)糖化菌,实际生产中主要用曲霉和根霉。,我国的糖化菌种经历了从米曲霉到黄曲霉，进而发展到用黑曲霉的过程。,历史上曾用过的曲霉包括黑曲霉、白曲霉、黄曲霉、米曲霉等，黑曲霉群中以宇佐美氏曲霉,(,Aspergillus usamii,),、泡盛曲霉,(,Asp.awamori,),和甘薯曲霉,(,Asp.batatae,),应用最广。白曲霉以河内白曲霉、轻研二号最为著名。酒精和白酒生产中，不断更新菌种，是改进生产、提高淀粉利用率的有效途径之一。,(二)酒精发酵微生物,啤酒酵母,(,Saccharomyces cerevisiae,),，是属于子囊菌亚门酵母属的一种单细胞微生物：繁殖速度快，产酒精能力强，耐酒精。,常用的酵母的菌株有南阳酵母,(1300,及,1308),、拉斯,2,号酵母,(Rasse,),、拉斯,12,号酵母,(Rasse,),、,K,字酵母、,M,酵母,(Hefe M),、日本发研,1,号、卡尔斯伯酵母等。,利用糖质原料的酒母除啤酒酵母外，还有粟酒裂殖酵母,(,Schizosaccharomyces pombe,),和克鲁维酵母,(,Kluyveromyces.sp,),等,细菌：森奈假单胞菌(,Ps.Lindneri,)、嗜糖假单胞菌(,Ps.saccharophila,)可以利用葡萄糖进行发酵生产乙醇。,总状毛霉深层培养时也要产生乙醇。,三、酒精发酵生化机制,糖质原料：酵母将糖转化成乙醇,淀粉质和纤维质原料：首先要进行淀粉和纤维质的水解（糖化），再由酒精发酵菌将糖发酵成乙醇。,淀粉结构,-葡萄糖淀粉酶能从淀粉的非还原末端逐个切下麦芽糖单位，但不能水解-1，6糖苷键，也不能越过-1，6糖苷键水解-1，4糖苷键，所以该酶水解支链淀粉时留下分子量较大的极限糊精。,葡萄糖淀粉酶能从淀粉的非还原末端逐个切下葡萄糖，它既能水解-1，6糖苷键，又能水解-1，4糖苷键。由于形成的产物几乎都是葡萄糖，因此该酶又称为糖化酶。,异淀粉酶专一水解-1，6糖苷键，因此能切开支链淀粉的分支。,总之，淀粉在以上几类酶的共同作用下被彻底水解成葡萄糖和麦芽糖。麦芽糖可在麦芽糖酶的作用下进一步生成葡萄糖。,另外，在糖化曲中除含有淀粉酶类外，还含有一些蛋白酶等，后者在糖化过程中能将蛋白质水解成胨、多肽和氨基酸等。,纤维素、半纤维素和木质素,纤维素是由葡萄糖通过-1，4糖苷键连接而成的聚合物，是一种结构上无分枝、分子量很大、性质稳定的多糖。其分子量可达几十万，甚至几百万。,纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，稻麦秸秆、木材、玉米芯的纤维素含量分别为4050、4050、53。在植物细胞壁中，纤维素总是和半纤维素、木质素等伴生在一起。,半纤维素是一大类结构不同的多聚糖的统称。构成半纤维素的成分有D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖等己糖，及D-木糖、L-阿拉伯糖等戊糖以及糖醛酸等。这些多聚糖的聚合度(DP)为60200，直链或分枝。,半纤维素与纤维素不同，它很容易水解，但由于它们总是交杂在一起，只有当纤维素也被水解时，才可能全部被水解。,本质素是由苯基丙烷结构单元通过碳-碳键连接而成的具有三维空间结构的高分子聚合物。,在用酸对纤维进行分级水解时，最后剩下的2030的非溶性残余物即为木质素，其性质极为稳定。,木质素在纤维素周围形成保护层，使后者的水解变得很困难。,根据采用的方法不同可将纤维素的水解法分成三种，即稀酸水解法、浓酸水解法和酶水解法。,纤维素酸水解所用的酸为硫酸、盐酸和氢氟酸等强酸。水解反应式为：,(C,6,H,10,0,5,)n十nH,2,0nC,6,H,12,0,6,纤维素酶：复合酶类，由C1和Cx组成。天然纤维素的分解过程是：纤维素先被Cl酶降解为较低分子化合物，同时具有水合性，其次由所谓Cx的几种酶作用形成纤维二糖。纤维二糖再由纤维二糖酶(-葡萄糖苷酶)水解成葡萄糖。,由于纤维素的性能稳定,无论用酸水解还是用酶水解，都存在水解速度慢,糖得率低的问题，这是影响纤维素科学利用的难题之一.,酵母菌在厌氧条件下可发酵己糖形成乙醇，其生化过程主要由两个阶段组成。第一阶段己糖通过糖酵解途径(EMP途径)分解成丙酮酸。第二阶段丙酮酸由脱羧酶催化生成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原成乙醇，整个过程由图5-3所示。葡萄糖发酵成乙醇的总反应式为：,C,6,H,12,O,6,2C,2,H,5,OH+2CO,2,+能量,酵母菌的乙醇发酵,主要生成乙醇，还生成少量甘油、有机酸（主要是琥珀酸）、杂醇油（高级醇）、醛类、酯类等,实际上只有约47的葡萄糖转化成乙醇：理论上1mol葡萄糖可产生2mol乙醇；即180克葡萄糖产生92克乙醇，的率为51.5%，可是实际得率没有这么高。因酵母菌体的积累约需2%的葡萄糖，另外2%的葡萄糖用于形成甘油，0.5%用于形成有机酸，0.2%用于形成杂醇油。,乙醇发酵中大部分能量仍储存于乙醇之中，所释放的226kJ自由能中除67kJ(29)用于形成ATP外，其余能量以热的形式散发。,四 酒精发酵工艺,所用原料不同，采用的工艺也不同。,原料预处理：除杂、粉碎,蒸料：要消耗整个生产过程蒸汽的25%30%无蒸煮的生淀粉(生料)发酵工艺、低温(100以内)蒸煮工艺膨化工艺和超细磨工艺等。,糖化曲制备,糖化方法分成间歇糖化和连续糖化两类。目前我国大多数酒精厂采用后者。,酒母制备,乙醇发酵：注意控温,包括前处理、酒母制备、乙醇发酵和蒸馏四个工序。,前处理包括的内容有：将糖蜜稀释至糖浓度为,12%,18%(,依不同的发酵工艺而异,),。糖蜜中常缺乏酵母必需的营养物质，需要添加一些氮源、营养盐,(,如硫酸铵、硫酸镁、磷酸盐等,),以及生长素,(,如酵母菌自溶物,),等。,乙酵发酵所用工艺主要是间歇法和连续法，糖蜜经上述前处理后，接入酒母，于3035发酵，成熟醪酒精度为6%9%(V/V)。,糖质原料酒精发酵工艺,啤酒制造工艺流程,二 新趋势,微生物改良：纤维素利用菌、耐高温淀粉酶、高产糖化酶的菌株选育、耐糖耐酒精耐高温的酵母,细菌酒精发酵,固定化细胞生产酒精,第二节 微生物发酵生产有机溶剂,甘油发酵：酿酒酵母、耐高渗酵母,丙酮丁醇发酵：丁酸梭菌、丁酸醇菌、丙酮丁醇梭菌,丁二醇发酵：产气肠杆菌、多黏杆菌,丙二醇发酵：工程菌,丙,酮,酸,乙醛,乙醇,CO2,H,H,乳酸,草酰乙酸,H,ATP,琥珀酸,丙酸,CO2,CO2,甲酸,(6),(5),(4),(3),(2),(1),H2,CO2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙醇,H,乙酰乳酸,CO2,3-羟基丁酮,H,2,3-丁二醇,CO2,H2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙酰乙酰CoA,CO2,ATP,ATP,H,H,丙酮,2-丙醇,丁酸,丁醇,H,甘油发酵,2ATP 2CO,2,NaHSO,3,2ATP 3-磷酸甘油醛,丙酮酸,乙醛,乙醛加,成物,Pi,G,1，6-二磷酸果糖 2H,EMP途径磷酸二羟丙酮,-磷酸甘油,甘油,亚硫酸盐法：添加剂、动态工艺系统,耐高渗酵母：减少酵母本身利用甘油、降低残糖、配套工艺。,丙酮丁醇发酵,故原料有哪些？,丁二醇发酵生产,三种异构体均可发酵生产，产量可达40-50%,回收工艺很关键：液液抽提、减压蒸馏,寻找新的菌种、工艺,丙二醇微生物生产,直接工程菌法发酵：产量低,肠道菌岐化：两步发酵法,有机酸,：给出氢离子的有机物泛指:羧酸（R-COOH）、磺酸（R-SO,2,OH）、亚磺酸（R-SOOH）、硫代羧酸（R-COSH）,种类多：一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸、多元羧酸,不饱和羧酸,广泛存在于植物果实中，提取不能满足需要,对人体有益，合成法不被人们所接受，发酵法生产的有机酸接近自然产物,糖、淀粉、酒精、石油等均可经微生物转化生成各种有机酸,最早:醋酸和乳酸利用乳酸菌自然发酵贮存加工青菜,已经投产：柠檬酸、葡萄糖酸、长链二羧酸、曲酸等,第三节 有机酸发酵,由微生物发酵产生的有机酸有60多种,柠檬酸,Aspergillus niger,（黑曲霉）,葡萄糖酸,Aspergillus niger,（黑曲霉）,醋酸,Acetobacter aceti,（醋化醋杆菌）,乳酸,Lactobacilus delbrackii,（德氏乳杆菌）,-,酮戊二酸,Candida sp,.（一种假丝酵母）,衣康酸等,Aspergillus terreus,（土曲霉）,水杨酸,Pseudomonas aeruginosa,（铜绿假单胞菌）,丙酸,Propioni bacterium shermanii,(谢氏丙酸杆菌),二.有机酸应用,1.在食品和饮料中的应用,酸味剂:汽水、硬糖、冰淇淋,水果罐头、果冻、果酱,保色作用,抑制腐败微生物生长,2.在医药工业中的应用,柠檬酸及钠盐是很好的抗凝血剂,葡萄糖酸钙补钙,3.在化学工业中的应用,洗涤剂（脱锈）:无毒、无污染,无毒电镀:柠檬酸盐镀锌溶液代替氰化物,化妆品、香皂沐浴液:防止氧化和除臭,制革工业等,4.其它工业,卷烟(乳酸或乳酸钠):防干燥、防霉变、增香,处理纤维(乳酸):柔软、光泽,显影剂(酒石酸),乳酸钙是重要的医药和饲料添加剂,（一）柠檬酸发酵,柠檬酸（citric acid）,枸橼酸,学名：2-羟基-丙烷三羧酸或,-羟基丙三酸,分子式C,6,H,8,O,7,，分子量192.13,无水柠檬酸是无色半透明全对称晶体,柠檬酸在化工、医药、食品等方面有广泛的用途,1893年前，主要从柑橘、菠萝和柠檬等提取,1893年后发现微生物（青霉）可产生柠檬酸,1951年美国Miles公司首先深层发酵法生产柠檬酸（,Aspergillus niger,）,我国20世纪40年代初开始浅盘发酵生产柠檬酸,60年代深层发酵,1.柠檬酸生产菌,青霉、毛霉、木霉、曲霉及葡萄孢霉等,利用淀粉质原料大量积累柠檬酸,国内利用黑曲酶（,Aspergillus niger,）,工艺:固体或液体深层发酵,原料:甘蔗渣、废糖蜜、白薯、马铃薯、,玉米等,2.柠檬酸发酵的原理,己糖、淀粉等原料,柠檬酸,生化过程复杂,EMP糖酵解途径,丙酮酸羧化,通过三羧酸循环形成柠檬酸,TCA循环与柠檬酸的形成,3.柠檬酸发酵的工艺,4.深层发酵工艺条件,1）温度：2830,初期温度稍高，有利于菌体繁殖,产酸期后温度稍低，有利于产酸,2）pH:,低 pH 条件下产生柠檬酸,中性 pH 条件下形成草酸,3）通气和搅拌,黑曲霉是好氧菌，提高发酵罐内溶氧水平可提高柠檬酸产量,4）培养基的液化,加少量,-,淀粉酶促进液化,5）接种方式：二级种子麸曲孢子,6）原料中糖的浓度,4.柠檬酸的提取,1）柠檬酸结晶,发酵液用蒸馏水搅匀,加热到100,C处理后10层纱布过滤,向清液中加入碳酸钙进行中和,使柠檬酸形成柠檬酸钙而沉淀析出,2）酸解,柠檬酸钙加水搅成糊状,用硫酸缓慢酸解,加入足够量的硫酸,使柠檬酸游离出来,3）脱色和去除各种阳离子,活性炭脱色,阳离子树脂去除各种阳离子,流出液pH为4时，开始收集,4）浓缩结晶,减压浓缩,冷却并缓慢搅拌,使结晶颗粒均匀,附：柠檬酸的质量标准（GB-198780）,柠檬酸含量,99.5%,硫酸盐（以SO4-计）,0.03%,草酸盐（以C2H4-计）,0.05%,重金属（以 Pb 计）,0.0005%,砷As）,0.0001%,铁（Fe）,0.001%,灼烧残渣,0.01%,钙盐 合格,其他有机酸生产：自学,衣康酸,苹果酸,乳酸,葡糖酸,己酸,要求：产生途径，国内外现状，生产菌种，工艺流程，原料，新工艺研究,第四节 氨基酸发酵,谷氨酸,赖氨酸,苏氨酸,芳香族氨基酸,反应式：,C,6,H,12,O,6,+NH,3,+3/2O,2,C,5,H,9,O,4,N+CO,2,+3H,2,O,1葡萄糖 1谷氨酸,理论转化率：147/180=81.7%,一 谷氨酸,一是提取法：甜菜厂付产物糖蜜中含有焦谷氨酸，用强碱处理可得到谷氨酸；,二是蛋白质水解法：将面筋加酸水解，再分离提纯。1957年发酵法生产谷氨酸在日本协和发酵公司投产。,我国1963年开始生产，1964年建立发酵法生产，全国大小厂家200多家，年产量15万吨之多，居世界首位，每年为国家创汇9亿元之多,我国工业生产味精使用的菌种主要是经过诱变育种得到的营养缺陷型的北京,谷氨酸棒状杆菌,正常代谢微生物是不会积累谷氨酸的。,谷氨酸生产菌能够在体外积累菌体最大生长需要量300多倍的谷氨酸，,研究表明，这种积累不是因为特异性途径，而是菌体代谢调节控制和条件控制的结果,：,代谢调节控制；,细胞膜通透性的特异调节；,发酵条件的适合；,生产菌株,已分离到的菌株属不同的属，但具有相似的,特性：,1）革兰氏阳性,2）不形成芽孢,3）没有鞭毛，不能运动,4需要生物素作为生产因子,5）在通气条件下才能产生谷氨酸,谷氨酸产生菌,棒杆菌属 北京棒杆菌,C.pekinense,Corynebacterium,钝齿棒杆菌,C.crenatum,谷氨酸棒杆菌,C.glutamicum,百合棒杆菌,C.lilium,美棒杆菌,C.callunae,力士棒杆菌,C.herculis,短杆菌属 乳糖发酵短杆菌,B.lactofermentum,revibacterium,黄色短杆菌,B.flvum,叉开短杆菌,B.divaricatum,硫殖短杆菌,B.thiogenitalis,产氨短杆菌,B.ammoniagenes,小杆菌属 嗜氨小杆菌,Microbacterium ammoniaphilum,节杆菌属 球形节杆菌,Arthrobacter globiformis,3C,6,H,12,O,6,6C,3,H,4,O,3,6C,2,H,4,O,2,+CO,2,6C,2,H,4,O,2,+2NH,3,+3O,2,2C,5,H,9,O,4,N+2CO,2,+6H,2,O,3C,6,H,12,O,6,+2NH,3,+9O,2,2C,5,H,9,O,4,N+8CO,2,+12H,2,O,即：,3,180,2147,此时，谷氨酸对葡萄糖的理论转化率为：,（294/540）100%=54.4%,葡萄糖,丙酮酸,草酰乙酸,柠檬酸,苹果酸,乙醛酸,异柠檬酸,-酮戊二酸,反丁烯二酸,谷氨酸,谷氨酸,琥珀酸,乙酰CoA,设法阻断的代谢,设法强化的代谢,CO,2,固定,柠檬酸合成酶,乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,谷氨酸脱氢酶,细胞膜渗透性,裂解酶,脱氢酶,控制生物素的量，以控制DCA循环的活性,DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，影响该酶活性的物质是醋酸（受其激活）。,（1）缺乏时，丙酮酸羧化酶活性弱。使草酰乙酸的量减少，醋酸浓度降低，使异柠檬酸裂解酶活性降低而关闭DCA环。,-,酮戊二酸脱氢酶活性极低或缺失,谷氨酸脱氢酶活性很高，不被低浓度的谷氨酸抑制,细胞膜对谷氨酸的通透性高,谷氨酸生产菌的主要生化特点,磷脂质,磷酸甘油,磷酸二羟丙酮,3-磷酸甘油醛,脂肪酸,乙酰CoA,柠檬酸,酮戊二酸,L-GA,葡萄糖,C,16,酸,C,18,酸,乙酸,葡萄糖,表活剂,生物素,n-石蜡,油酸,油酸,G途径,石蜡途径,甘油缺陷部位,表活剂拮抗部位,细菌谷氨酸排泄控制部位,L-GA,目前，关于谷氨酸如何分泌出细胞（积累）有几种报道：,渗 漏 模 型,载体逆转模型,分泌载体模型,谷氨酸分泌机制,1切断或减弱支路代谢：减弱-酮戊二酸进一步氧化，选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株，选育不分解利用谷氨酸的突变株，选育减弱乙醛酸循环的突变株,2解除自身的反馈调节：耐高糖、高谷氨酸浓度,3增加前体物的合成：选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到-酮戊二酸代谢的突变株、选育强化CO2,固定反应的突变株,4提高细胞膜的渗透性：生物素、油酸、甘油等缺陷型、温敏型,谷氨酸生产菌的育种思路,谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸,特点：,谷氨酸积累过量会抑制谷氨酸脱氢酶活性,如何使细胞内的谷氨酸不会抑制谷氨酸脱氢酶恬性？如何使细胞内谷氨酸浓度下降？如何使谷氨酸通过细胞膜由细胞内到达细胞外？,改变细胞膜透性,将细胞内谷氨酸透出细胞,细胞内谷氨酸浓度下降,新趋势,利用基因工程技术构建新型谷氨酸工程菌株,改善工艺：电脑控制，最优组合,日本提高谷氨酸产率的方法,耐谷氨酸或者耐类谷氨酸生产菌：,以短杆菌(Breribacterium)或棒杆菌(Corynebacterium)作亲株,诱变得到耐谷氨酸和类谷氨酸性的变异株,在液体培养基中通气培养,能积累高谷氨酸。,采用的菌株有:耐谷氨酸铵的乳糖发酵短杆菌 AJ11292、黄色短杆菌 AJ11294、嗜乙酰乙酸棒杆菌 AJ11296、耐谷氨酸 r-单氧污盐的乳糖发酵短杆菌 AJ11293、嗜乙酰乙酸棒杆菌 AJ11297、耐-甲基谷氨酸的黄色短杆菌 AJ11295、谷氨酸棒杆菌 AJ11299,异柠檬酸裂解酶活性较低的：,研究用异柠檬酸裂解酶活性低的菌株进行谷氨酸发酵可提高 L-谷氨酸产量,提高糖酸转化率 5%-15%。,这些菌株为：(1)乳 糖 发 酵 短 杆 菌 AJ11516,是ATCC13689 的变异株,醋酸缺陷型,异柠檬酸裂解酶活性低。(2)黄色短杆菌 AJ11518,是 ATCC14067 的变异株,异柠檬酸裂解酶活性几乎检不出。,转化糖蜜与甘蔗糖蜜混合发酵：,转化糖蜜是用甘蔗压榨汁的清液用蔗糖酶处理后的物质。研究采用转化糖蜜和甘庶糖密以 3:79:1 比例混合制成混合糖蜜,再添加日常发酵所使用的培养基,进行谷氨酸发酵,可明显提高谷氨酸发酵产率。,二 赖氨酸,赖氨酸虽广泛存在于自然界的动植物蛋白中，但动物蛋白的赖氨酸含量较高，植物蛋白的赖氨酸含量较低。对谷类补充赖氨酸可提高其营养价值。促进家禽、家畜生长发育。被大量用作饲料添加剂。在医药上，也可用于配制氨基酸输液。赖氨酸泛酸盐可用于治疗白细胞减少症。,赖氨酸：,lysine,分子中含有二个氨基（,NH2,）和一个羧基（,COOH,），是一种具有明显碱性的氨基酸，也是人体八种必需氨基酸之一。,直接发酵法是目前生产赖氨酸的主要方法。采用的生产菌主要有谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌的代谢调节突变株。,我国的Lys生产与国外的差距主要表现在：,（1）菌种性能的差异，Lys 是菌体代谢过程中的中间性产物，但不是主链上的产物，其生成机制很复杂，对菌种的要求很高，国内菌种的产酸水平为：3555g/L，转化率为：2025%。远低于国外的生产水平。,（2）提纯率较低。,（3）生产规模较小。,赖氨酸的合成途径,不同种类的微生物途径不同：,1.二氨基庚二酸的生物合成途径，如细菌；,2氨基己二酸途径：如酵母菌、霉菌。,（1）菌体体积较小，相对增殖所用的底物较少，产率高。,（2）细菌的繁殖速度快，在合适的生长条件下，其繁殖速度只有几分钟，而酵母的增殖速度最少在一个小时以上，这就为细菌发酵缩短发酵周期创造了条件。,（3）细菌的细胞膜的通透性易于调节，对于胞外产品，可以通过其细胞膜的通透性控制来促进产物的分泌，例如，谷氨酸的发酵；对于胞内产物，其细胞壁比酵母的细胞壁易于破碎。,目前的赖氨酸发酵生产都是采用细菌为生产菌种，采用细菌发酵的优点有以下三点：,缺点：,（1）细菌菌体较小，当需要从发酵液中把菌体分离出来（有利于产物的结晶提出，或产物就是菌体或菌体内的胞内物），细菌比酵母菌难以分离。,（2）细菌发酵过程中的无菌程度要求非常严格，发酵过程中大部分的细菌对于溶氧的要求也很高，这就增加了细菌发酵的生产成本。,（3）细菌发酵易感染噬菌体。,葡萄糖,天冬氨酸,（草酰乙酸）,天冬氨酰磷酸,高丝氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,-酮丁,酸,异亮氨酸,赖氨酸,二氨基庚二酸,天冬氨酸激酶,EMP、TCA,图一 细菌赖氨酸生物合成途径,高丝氨酸脱氢酶,DDP合成酶,高丝氨酸激酶,高丝氨酸-O-转乙酰酶,赖氨酸合成途径的调节,3个关键酶：,一是,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PC)：,受Asp的反馈抑制,二是,天冬氨酸激酶(AK),受Lys和Thr的协同反馈抑制；,三是,二氢吡啶二羧酸合成酶(DDP合成酶),受亮氨酸的代谢互锁作用。,葡萄糖,PEP,Pyr,乙酰CoA,OAA,TCA循 环,ATP,Ala,Val,Leu,脂肪酸,Asp,ASA,Lys,Thr,生物素,乙酰CoA,抑制,阻遏,激活,Leu,Lys合成调节途径,赖氨酸发酵育种思路,优先合成的转换：渗漏缺陷型,切断支路代谢选育营养缺陷型,选育抗结构类似物突变株,解除代谢互锁,增加前体物的合成和截断副产物生成,改善细胞膜的透过机理,选育温度敏感突变株,利用细胞工程和基因工程技术,防止高产菌株回复突变,思考：根据以上理论，请问苏氨酸和高丝氨酸生产菌的育种途径？,芳香族氨基酸：经分枝酸途径合成,苯丙氨酸 酪氨酸 色氨酸,微生物合成芳香族氨基酸的途径是相同的，但酶学及基因支配情况因种类不同而异，因此，代谢调节机制不同。,三 芳香族氨基酸,芳香族氨基酸合成途径,PEP,+E-4-p,DAHP 分枝酸 预苯酸 苯丙酮酸 苯丙氨酸,邻氨基苯甲酸 对羟基苯丙酮酸 酪氨酸,5-p-核糖邻氨基苯甲酸,吲哚-3-甘油磷酸,色氨酸,PEP,+E-4-p,DAHP 分枝酸 预苯酸 苯丙酮酸 苯丙氨酸,邻氨基苯甲酸 对羟基苯丙酮酸,5-p-核糖邻氨基苯甲酸 酪氨酸,吲哚-3-甘油磷酸,色氨酸,反馈抑制 阻遏,同工酶,大肠杆菌中芳香族氨基酸代谢调控机制,在黄色短杆菌中：,优先合成：酶活性+底物亲和力,产物抑制本途径的酶活性,优先合成顺序：,色氨酸,酪氨酸 苯丙氨酸,黄色短杆菌芳香族氨基酸合成调节机制,PEP,+E-4-p,DAHP 分枝酸 预苯酸,对羟基苯丙酮酸 酪氨酸,邻氨基苯甲酸 苯丙酮酸 苯丙氨酸,色氨酸,反馈抑制 激活,优先合成,PEP+EP,DAHP,CA,PPA,Tyr,Phe,邻氨基苯甲酸,Trp,解除反馈调节的代谢流,切断或减弱的支路代谢,色氨酸生产菌,DS,AS,TS,CM,色氨酸生产菌 的育种途径,第五节 核苷酸发酵,全合成途径：“从无到有途径”，由磷酸戊糖开始直到生成核苷酸。,补救途径：分段合成途径。由食物中取得完整的嘌呤或嘧啶和戊糖、磷酸，通过酶转化成单核苷酸。,5-Pi-R,PRPP,PRA,GAR,FGAR,FGAM,AIR,CAIR,SAICAR,AICAR,FAICAR,IMP,ATP,AMP,Gln,Glu,ATP,ADP,Gly,甲酰THFA,THFA,Gln,Glu,ATP,ADP,CO,2,ATP,ADP,天冬氨酸,延胡索酸,甲酰THFA,THFA,水,嘌呤核苷酸全合成途径,ATP,GTP,磷酸化,磷酸化,在产氨短杆菌中，从IMP开始分出的两条路线不是环形，而是单向分支路线。GMP和AMP不能相互转变。,NH,3,+CO,2,UTP,CTP,核苷酸,核苷,碱基,5-核苷酸酶,激酶,ADP,ATP,R-1-P,P,PP,PRPP,嘌呤碱基、核苷和核苷酸的相互转换,核苷磷酸酶,核苷酸焦磷酸化酶,(1),肌苷酸生产菌,增强合成：腺嘌呤缺陷Ade,-,+黄嘌呤缺陷Xan,-,；切断缺损SAMP合成酶，解除AMP、ADP、ATP对PRPP转氨酶的反馈抑制作用。,减弱分解：IMP脱氢酶缺陷株；IMP因不能转化为XMP而积累。,解除细胞膜通透性障碍。,鸟苷酸生产,GMP生产方法：,细菌生产鸟苷,化学磷酸化,微生物发酵生产AICAR(S)化学合成,双菌混合发酵：不同微生物分别负责两段,直接发酵法,目前，一步法发酵生产GMP的技术问题还未解决。,应用：,鸟苷产生菌+磷酸化：枯草杆菌抗性突变株；,缺失SAMP合成酶（切断IMP到AMP的通路）和GMP还原酶（使生成的GMP不能变成IMP）缺失核苷酸酶和碱性磷酸脂酶：GMP不被降解。,解除GMP对IMP脱氢酶及GMP合成酶等的反馈抑制和阻遏。,解除各产物对IMP合成相关酶的调节，积累IMP。,使IMP脱氢酶和GMP合成酶反应优先于核苷酸酶反应，抑制肌苷生成。,AICAR(S)产生菌+化学合成,要求：,嘌呤的生物合成途径强,丧失AICAR(S)转甲酰酶,解除了对PRPP转酰胺酶的反馈抑制和阻遏,降解AICAR(S)的酶系（核苷酸酶、磷酸酯酶、核苷酶etc.）弱。,直接发酵法菌种要求：,解除GMP对IMP脱氢酶的反馈抑制,生成的GMP不被降解,具有分泌GMP的高通透性。,两步发酵或混合发酵法：一种微生物积累黄苷或者黄苷酸，另一种转化。,对黄苷或黄苷酸生产菌的要求,(双重缺陷),：,鸟嘌呤缺陷(Gu,-,):缺失XMP胺化酶(XMP难生成GMP)，解除GMP对IMP脱氢酶的反馈抑制和阻遏。,腺嘌呤缺陷(同时)：,切断IMP,AMP，,解除腺嘌呤对PRPP酰胺基转移酶的反馈作用。,已发现的酶近,3000,种,应用于工业、医药、遗传工程、分析研究领域的酶有,2500,种,工业生产商品酶,5060,种,大规模工业生产的有,10,多种,研究用商品酶,300400,种,第六节 酶制剂发酵,在工业用酶中,蛋白酶占59%，碱性25%、中性12%、,糖化酶占13%、,-,淀粉酶5%、葡萄糖异构酶6%,果胶酶3%、纤维素酶1%,脂肪酶3医药分析与研究用酶10%,部分国家的酶产量,国家 酶生产量（吨/年）,丹麦 50000,荷兰 20000,德国 5000,法国 2500,英国 2500,美国 10000,日本 10000,中国酶制剂:50年代上海,主要微生物酶制剂,细菌-淀粉酶 枯草杆菌 纺织品退浆,霉菌-淀粉酶 米曲霉 消化剂,糖化酶 黑曲霉 造葡萄糖 白酒,霉菌酸性蛋白酶 栖土曲霉 皮革脱毛,放线菌蛋白酶 放线菌 皮革脱毛,细菌中性蛋白酶 枯草杆菌 皮革脱毛等,葡萄糖异构酶 放线菌 制造高果糖浆,链激酶 链球菌 治疗静脉血栓,脂肪酶 假丝酵母 皮革脱脂,纤维素酶 绿色木酶 水解纤维素,溶菌酶 蛋清 科学研究,过氧化氢酶 细菌 霉菌 杀菌、防腐等,葡萄糖氧化酶 霉菌,除去蛋白中的,葡萄糖、分析葡萄糖、酶电极、防止食品氧化,一.淀粉酶的分类及作用方式,淀粉:葡萄糖多聚物，直链淀粉和支链淀粉,直链淀粉：,-1，4糖苷键,支链淀粉：直链淀粉基础上又由,-1，6糖苷键,连接产生分支,直链淀粉占1020%,支链淀粉占8090%,淀粉酶：,催化淀粉水解成糊精、麦芽糖,或葡萄糖的一类酶的总称,包括：,-淀粉酶（,-amylase）,-淀粉酶,淀粉1，4葡萄糖苷酶,淀 粉-1，6葡萄糖苷酶,（一）,-淀粉酶（,-amylase,，液化型淀粉酶）,从淀粉分子内部作用于,-1，4糖苷键,不作用,-1，6糖苷键、靠近,-1，6糖苷键,的,-1，4糖苷键,结果：麦芽糖、含有6个葡萄糖单位的寡糖,带有支链的寡糖,使淀粉溶液的,黏度,下降,1.产生菌,细菌：,枯草杆菌（,Bacillus subtilis,）,地衣芽孢杆菌（,B.licheniformis,）,解淀粉芽孢杆菌（,B.amyloliquefaciens,）,嗜碱芽孢杆菌（,B.alkalophilus,）,多粘芽孢杆菌（,B.polymyxa,）,嗜热脂肪芽孢杆菌（,B.stearothermophilus,）,施氏假单胞菌（,Pseudomonas stutzeri,）,放线菌:,灰色链霉菌（,Streptomyces griseus,）,霉菌,毛霉（,Mucor,),根霉（,Rhizopus,）,曲霉（,Aspergillus,）,2.细菌,-淀粉酶的生产（液体深层发酵）,工艺流程：,斜面菌种,孢子悬液种子扩大培养罐发酵热处理盐析压滤干燥粉碎成品,霉菌,-淀粉酶主要以固体曲生产,工艺流程：,斜面菌种,三角瓶菌种种曲厚层通风培养粉碎抽提过滤沉淀压滤烘干等,3.,-淀粉酶的提取,工业用酶：,1）沉淀(硫酸胺或酒精),-淀粉酶同菌体一起,析出,过滤、干燥和粉碎,粗酶制剂,2）发酵液中加入稳定剂,直接喷雾干燥,3）用淀粉吸附回收酶,4.,-淀粉酶的纯化,发酵液,离心去菌体硫酸胺盐析淀粉吸附,丙酮分段DEAE-纤维素柱层析Sephadex,G-100凝胶过滤透析冷冻干燥纯品,5.,-淀粉酶的性质,分子量50KD，含一个Ca,2+,酸性、中性和碱性,-淀粉酶,-淀粉酶,最适pH 分别为3.5-4.5，6-7，8-10,最适温度为5060C,6.,-淀粉酶的应用,1）消化药物：黑曲霉酸性,-淀粉酶,2）面包工业：米曲霉,-淀粉酶,耐热性较差,3）淀粉液化及棉布退浆,耐热性,-淀粉酶,（二）糖化型淀粉酶,淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖（一类酶）,1.,-淀粉酶,从非还原性末端按双糖单位,作用,-1，4糖苷键,，产生麦芽糖,不作用,-1，6糖苷键,不能越过,-1，6糖苷键,产物：麦芽糖与极限糊精,2.淀粉1，4葡萄糖苷酶,非还原性末端,以葡萄糖为单位作用于,-1，4糖苷键,生成葡萄糖,能跃过,-1，6糖苷键继续作用,-1，4糖苷键,直链淀粉：葡萄糖,支链淀粉：葡萄糖、带有,-1，6糖苷键的寡糖,3.淀 粉-1，6葡萄糖苷酶（异淀粉酶）,专门作用于淀粉分子的,-1，6糖苷键,生成葡萄糖,水解,-淀粉酶和,-淀粉酶作用后的产物,二.蛋白酶,催化肽键水解的一类酶,30年代：微生物蛋白酶用于食品和制革,50年代：发现霉菌能产生几种类型的蛋白酶,60年代：碱性蛋白酶在洗涤剂中添加应用,目前已纯化和结晶的蛋白酶有100种以上,有些酶的高级结构已被阐明,近年来极端酶的研究受到重视,1.蛋白酶的分类,1）来源：木瓜蛋白酶 菠萝蛋白酶,胰蛋白酶 胃蛋白酶等,2酶活性部位：丝氨酸蛋白酶,巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶,3）酶最适pH：碱性蛋白酶,中性蛋白酶和酸性蛋白酶,产蛋白酶微生物：细菌、放线菌、霉菌,2.蛋白酶的应用,1）食品工业：干酪生产、肉类嫩化、啤酒澄清,2）酿造和发酵工业：酱油、豆酱等酿造,3）医药工业：消炎消肿，治疗慢性气管炎,血栓静脉炎、盆腔炎、各种烧伤疤痕的软化,4）洗涤剂：加酶洗涤剂,5）水产加工：鱼肝油去除蛋白、鱼类加工,鱼品脱腥等,6）其它：加酶牙膏、制造蛋白水解物,4.蛋白酶产生菌的分离筛选,1）样品采集,2）微生物的分离,3）获得微生物的纯培养（pure culture）,4)蛋白酶产生菌的获得方法,含酪蛋白培养基的应用,三.纤维素酶（cellulase）,纤维素广泛存在于自然界（枝叶与秸秆）,葡萄糖通过,-1，4糖苷键连接大分子物质,分子量大，不溶于水,人和动物不能直接消化,木酶、青霉、放线菌、细菌都能产纤维素酶,纤维素酶是一类纤维素水解酶的总称,C1酶,Cx酶,天然纤维素,水合纤维素分子,-葡萄糖苷酶,纤维二糖,葡萄糖,微生物纤维素酶在解决粮食、食品、饲料,等方面具有重要意义,四.酶的分离纯化,1.粗酶液的制备,2.硫酸胺分级沉淀,3.层析：离子交换层析、亲和层析,4.凝胶过滤,5.电泳：分析电泳，制备电泳,6.等电聚焦,防止酶的失活,五.酶的基因克隆,1.研究意义,2方法：,1）PCR方法,2）RT