1、单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验目的、要求,（1）学习并掌握细菌、放线菌、霉菌和酵母菌等四大类微生物的稀释分离、划线分离等技术。,（2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。,（3）了解四大类微生物的培养条件和培养时间。,（4）学习平板菌落计数法,（下次实验）,。,以细菌为例,实验原理,纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。,分离,：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。,纯种（纯培养）,：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。,微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优
2、良菌种及纯化被污染的菌种等。,土壤是微生物的大本营，混杂着大量的微生物，从中分离可得到只含有这一种微生物的纯培养。,稀释分离法,有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用,划线法,进行纯种分离。,要获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的,最适培养基及培养条件,。,微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间详见,实验指导书,P,67,表格。细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，在30-37 温度下培养1-2天。,平板菌落计数活菌计数,0.9,0.1,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.1ml,0.9ml,分离纯化基本
3、流程,3、分离,1）涂布法,用一支,新的无菌枪头,，由,低浓度开始,，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，,对号较均匀,地放入已写好稀释度的牛肉蛋白胨培养基平板上，用,灼烧冷却,后的无菌玻璃涂棒,涂匀,。每个浓度做3个平板（重复）。,2）倾注法,用一支,新的无菌枪头,，由,低浓度开始,，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，,对号较均匀,地放入已写好稀释度的空白无菌平皿中，然后在各平皿中加入,已经融化,并冷却到,45-50,的牛肉膏蛋白胨培养基（,已灭菌,）,12-15ml,，将培养皿在超净工作台面上轻轻转动，使稀释的菌悬液与融化的培养基,混合均匀,，,直至培养基凝固,。,注意：无菌操作；用
4、枪头吸取菌悬液时注意“吹打数次”确保混匀。,4、培养,待平板上液体被完全吸收，将平板倒置于37,0,C温箱中培养24h；,5、菌落计数,含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可据平板上菌落的数目推算出每克含菌样品中所含的活菌总数（菌落形成数目）。,每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，,CFU,（同一稀释度平板上菌落平均数 10稀释倍数）/含菌样品克数,菌落计数规则：,选择平均菌落数在30300间的平板,1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌
5、落数的值）：,1）若0.5,比值,2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告。,2）若2,比值或比值,0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。,3、若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,4、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；,所有菌落数均不在30300间,以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数,6、,挑菌划线分离,挑取单个菌落（细菌菌落），分别在平板上做分区和连续划线。,37,0,C培养48h检查菌落是否单纯。,划线方法：详见实验指导书P72、P237,无菌操作（近火焰处操作）：,接种环灼烧灭菌、冷却 左手取涂布分离培养后平板 右手用接种环挑取涂布分离培养的平板中的目的单菌落 用已经粘有菌体的接种环 于另一新的空白平板中划线,分区划线法：灼烧、冷却、取菌 区1划线 灼烧、冷却 区2划线 区3划线 灼烧、冷却 区4划线,完毕、灼烧,连续划线法：灼烧、冷却、取菌 连续划线 完毕、灼烧,结果与讨论,计算含菌样品中的所含活菌总数,在恒温箱中培养微生物时为何要倒置？,7、斜面接种,选择分离效果较好，认为已经纯化的单菌落，挑选一个，用接种环接种斜面。贴好标签。,8、培养,置37,0,C恒温箱中培养24h，置冰箱保藏。,
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