第十一章核酸的物理化学性质.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十一章 核酸的物理化学性质,一.核酸的水解,核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。,DNA,和,RNA,对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在0.1,mol/L NaOH,溶液中，,RNA,几乎可以完全水解，生成2-或3-磷酸核苷；,DNA,在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与,RNA,核糖基上2-,OH,参与作用有很大的关系。在,RNA,水解时，2-,OH,首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用下形成水解产物。,酸易水解,N-,糖苷键,，嘌呤碱基比嘧啶碱基易被酸水解，脱氧核糖比核糖的糖苷键易水解，,DNA,的嘌呤碱在,pH2,以下即脱落而成嘌呤酸。,碱易水解,磷酸酯键,，,RNA,在0.3,N,碱中即被水解，,DNA,对碱相对稳定。,酶水解,生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。,核酸酶的分类,按底物专一性分：以,DNA,为底物的,DNA,水解酶（,DNases）,和以,RNA,为底物的,RNA,水解酶（,RNases）。,按作用方式分：,核酸外切酶和核酸内切酶。,核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。,按作用键分：水解3-磷酸酯键和5-磷酸酯键的核酸酶，产物分别是5-磷酸核苷和3-磷酸核苷,二.核酸的酸碱性质,两性解离,：,DNA,无，只有酸解,，,碱基被屏蔽（在分子内部形成了氢键）。,RNA,有两性解离，有,pI,。,核酸的碱基,、,核苷,、,核苷酸均能发生解离，因此核酸是两性电解质,碱基的解离,：嘧啶和嘌呤环上的,N,及各取代基,具有结合和释放质子的能力。,核苷的解离,：碱基和核糖具有结合和释放质子的能力,核酸的解离,：磷酸基具有较强的酸性，核酸的两性解离主要决定于,磷酸基和含氮碱基,。,三.核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在,260,nm,左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据。,以,A,260,/A,280,进行定性、定量,DNA,和,RNA,溶液中加入,溴化乙锭（,EB）,，,在紫外线下发出荧光。,用,A260/A280,还可用来表示核酸的纯度：,大于1.8，,DNA,很纯；,大于2，,RNA,很纯。,样品中如含有杂蛋白及苯酚，比值明显,降低,。,对于纯的样品，只要读出260,nm,的,A,值即可算出含量。通常以,A,值为1,相当于,50,g/ml,双螺旋,DNA,，,或,40,g/ml,单链,DNA（,或,RNA）,，,或,20,g/ml,寡核苷酸计算。,有时核酸的紫外吸收以,摩尔磷的吸光度,来表示，,摩尔磷即相当于摩尔核苷酸,。,先测定核酸溶液中的磷含量及紫外吸收值，然后求出摩尔磷吸光系数,(P)。,(P)=A/,cL,A,为吸收值，,c,为每升溶液中磷的摩尔数，,L,为比色杯内径。,c=,每升中磷的重量（克）,W/,磷的原子量（30.98）,(P)=30.98,A,/,WL,一般天然,DNA,的,(P),为6 600，,RNA,为7 700-7 800。核酸的,(P),值较所含核苷酸单体的,(P),要低40%-45%。,单链多核苷酸的,(P),值比双螺旋结构多核苷酸的,(P),要高，所以核酸发生变性时，,(P),升高约25%，此现象称为,增色效应（,hyperchromic effect）,。,复性后,(P),又降低，这现象称,减色效应(,hypochromic effect)。,四.核酸的变性，复性及杂交,(一,),变性,稳定核酸双螺旋的次级键断裂，空间结构破坏，变成单链结构的过程。,核酸的一级结构(核苷酸顺序)保持不变。,变性表征,生物活性部分丧失、粘度下降、浮力密度升高、紫外吸收增加（增色效应）,变性因素,pH（11.3,或5.0）,变性剂（脲、甲酰胺、甲醛）,低离子强度,加热,热变性与,Tm,DNA,的变性过程,是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称,熔解温度,用,T,m,表示。（或者把加热变性使,DNA,的双螺旋结构失去一半时的温度称为该,DNA,的熔点或熔解温度）。,一般,DNA,的,T,m,值在82-95,C,之间。,DNA,的,T,m,值大小与下列因素有关：,（1）,DNA,的均一性。均质,DNA，,如一些病毒的,DNA，,人工合成的,poly d(A-T),poly d(G-C),熔解过程发生在一个较小的范围内。异质,DNA,熔解的过程发生在一个较宽的范围内。所以,Tm,值可作为衡量,DNA,样品均一性的标准。,（2）分子中,G,和,C,的含量。,G,和,C,的含量高，,T,m,值高,。因而测定,T,m,值，可反映,DNA,分子中,G,C含量，可通过经验公式计算：,（,G+C)%=(,T,m,-69.3)2.44,（3）介质的离子强度。一般离子强度较低的介质中，,DNA,的熔解温度较低，而且溶解温度的范围较宽。,盐浓度对,DNA,变性的影响,RNA,的变性,：,RNA,也具有螺旋 线团之间的转变。但这种较变不如,DNA,明显。变性曲线不陡，,T,m,值较低。,tRNA,具有较多的双螺旋区，所以具有较高的,T,m,值，变性曲线也较陡。,（二）复性,变性核酸的互补链在适当的条件下，重新缔合成为双螺旋结构的过程称为,复性,。,DNA,复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复，具有,减色效应,。,将热变性的,DNA,骤然冷却至低温时，,DNA,不可能复性。变性的,DNA,缓慢冷却时可复性，因此又称为“退火”。,退火温度,T,m,25,复性影响因素,片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,将热变性的,DNA,骤然冷却时，,DNA,不可能复性,DNA,的片段越大，复性越慢,DNA,的浓度越大，复性越快,在一定条件下，复性反应的速度用,Cot,1/2,来衡量，,Co,为变性,DNA,复性时的初始浓度，,t,为时间，,Cot,表示复性一半时的,DNA,浓度。,两种浓度相同但来源不同的,DNA，,复性时间的长短与基因组的大小有关,有很多重复序列的,DNA,复性也快,（,三）核酸的杂交,DNA,单链与在某些区域有互补序列的异源,DNA,单链或,RNA,链形成双螺旋结构的过程。这样形成的新分子称为,杂交,DNA,分子,。,核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,Southern,杂交（,Southern bolting）,Northern,杂交（,Northern bolting）,Western,杂交（,Western bolting）,核酸分子杂交（,DNA/DNA or DNA/RNA）,技术,核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（,Cavnegie,Institute of Washington）,的,Roy,Britten,及其同事发明的。所依据的原理是，,带有互补的特定核苷酸序列的单链,DNA,或,RNA，,当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。,核酸的杂交,核酸分子杂交的意义：,发现原核生物的基因是连续基因，而真核生物的基因是断裂基因。,连续基因,：基因中的,bp,序列能够连续的在成熟的蛋白质中找到其相应的,AA，,电镜显示这种基因能够和它的成熟,mRNA,形成平滑的杂交分子。,断裂基因,：基因中的,bp,序列能够断续的在成熟的蛋白质中找到其相应的,AA，,电镜显示这种基因和它的成熟,mRNA,只能形成带泡的杂交分子。,发现癌基因的普遍性,：肿瘤病毒的,RNA,能够与人类正常的,DNA,分子形成带泡的杂交,分子。,核酸分子杂交的技术,Southern Blotting（,南印迹）,：用于钓基因，即用已知的,DNA,单链或,RNA，,钓取未知,DNA,分子中的基因，方法如下：未知的,DNA-DNA,限制性内切酶,DNA,片段 琼脂糖电泳分离 碱液变性 影印在硝酸纤维薄膜上 与放射性标记的已知,DNA,单链或,RNA,杂交 放射自显影,Northern Blotting（,北印迹）,：用已知的,DNA,钓,mRNA，,方法如下：众多未知的,RNA,电泳分离 变性 影印 用标记的已知,DNA,单链杂交 放射自显影,Western Blotting（,西印迹）,：蛋白质与抗体的杂交，跟核酸无关。,Southern,DNA,印迹杂交,根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的,DNA,片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同位素标记的单链,DNA,或,RNA,探针的杂交作用,检测这些被转移的,DNA,片段,，这种实验方法叫做,DNA,印迹杂交技术,。由于它是由,E.Southern,于1975年首先设计出来的，故又叫,Southern DNA,印迹转移技术。,Southern,凝胶转移,杂交技术,（,a）,（,b）,（,c）,（,d）,（,e）,基因组,DNA,DNA,限制片段,硝酸纤维素滤膜,同探针同源杂交的基因,DNA,片段,X,光底片,Southern Blotting,DNA,migration,DNA Marker,Gel,Paper towels,Salt,solution,Northern,RNA,印迹技术（,Northern blotting）,1979,年，,J.C.,Alwine,等人发展而来，是将,RNA,分子,从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与,Southern,DNA,印迹杂交技术十分类似，所以叫做,Northern,RNA,印迹技术（,Northern blotting）。,将,蛋白质,从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素,125,I,标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做,Western,蛋白质杂交技术,（,Western blotting,）。,