鼠伤寒沙门氏菌哺乳动物肝微粒体致突变性实验.ppt

鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验鼠伤寒沙门氏菌微粒体酶试验Ames test原原 理理鼠鼠伤寒沙寒沙门氏菌氏菌野生型（原养型）野生型（原养型）人工方法正向诱变鼠鼠伤寒沙寒沙门氏菌氏菌组氨酸缺陷型（异养型）氨酸缺陷型（异养型）诱变物作用回复突变 AmesAmes是检测遗传毒理学的体是检测遗传毒理学的体外试验，检测终点是基因突变外试验，检测终点是基因突变通过统计回复突变的菌落数通过统计回复突变的菌落数判断受试物质的致突变性高低判断受试物质的致突变性高低S-9S-9混合液的制备过程混合液的制备过程（使需要代谢激活的物质（使需要代谢激活的物质得以活化）得以活化）2 25 53 34 41 1暴露肝暴露肝脏，KCL灌注灌注断断头处死大鼠、放血、去皮死大鼠、放血、去皮取出肝取出肝脏，加入，加入KCL剪碎剪碎制成匀制成匀浆，9000g离心离心取上清、分装、取上清、分装、冻存存1 实验用菌液制备实验用菌液制备 平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待，是种统计物品含菌数的有效方法。方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。2 菌株性状鉴定菌株性状鉴定 （1）组氨酸营养缺陷型）组氨酸营养缺陷型 （2）深粗糙突变测定）深粗糙突变测定 （3）R因子的鉴定因子的鉴定 （4）切除修复缺失鉴定切除修复缺失鉴定 （5）自发回变量测定）自发回变量测定 （6）回变特性鉴定）回变特性鉴定实验步骤与方法实验步骤与方法深粗糙深粗糙（rfa）特性特性2紫外线敏感（紫外线敏感（UvrB）特性）特性3抗氨苄青霉素（抗氨苄青霉素（R因子）特性因子）特性4回变特性鉴定回变特性鉴定6组氨酸需求特性组氨酸需求特性1菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定自发回变特性自发回变特性51、组组氨氨酸酸需需求求特特性性有细菌生长有细菌生长空白空白空白空白组氨酸组氨酸-生物素生物素赖氨酸赖氨酸空白空白37 24h0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定2、深深粗粗糙糙（rfa）特特性性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层普通培养基普通培养基抑菌环抑菌环滤纸片（有结晶紫）滤纸片（有结晶紫）3724h24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定3、紫紫外外线线敏敏感感特特性性普通培养基普通培养基15W紫外灯紫外灯33cm，8s37，24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定4、抗抗氨氨卞卞青青霉霉素素（R R因因子子）特特性性37，24h青霉素青霉素普通培养基普通培养基菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定5、自自然然回回变变特特性性0.1ml0.1ml菌液菌液顶层顶层底层底层37，24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株菌株基因型基因型组氨酸氨酸缺陷缺陷脂多糖脂多糖屏蔽缺失屏蔽缺失抗氨卞抗氨卞西林西林抗四抗四环素素uvrB修修复缺陷复缺陷自自发回回变（-S9）TA97+-+90-180TA98+-+30-50TA100+-+120-200TA102+-+240-320AmesAmesAmesAmes试验菌株特性试验菌株特性试验菌株特性试验菌株特性6、回回变变特特性性鉴鉴定定0.1ml0.1ml菌液菌液0.1ml0.1ml致突变物致突变物0.2-0.5mlS-90.2-0.5mlS-9顶层顶层底层底层37，24h菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定菌株特性鉴定实实验验设设计计原原则则受试物最低剂量为每皿受试物最低剂量为每皿0.1g0.1g一般选用一般选用4545个剂量个剂量 每个剂量应做每个剂量应做2 2或或3 3个平行平皿个平行平皿 设立阳性对照和阴性（溶剂）对照设立阳性对照和阴性（溶剂）对照 受试物最高剂量为每皿受试物最高剂量为每皿5mg5mgAmesAmes试验设计试验设计点试法点试法点试法将将顶层培养基倒入底培养基倒入底层培养基中，凝培养基中，凝固后放入固后放入滤纸片，将受片，将受试物点在物点在纸片片上放入底上放入底层，37培养培养48h观察察结果果掺入法掺入法掺入法掺入法掺入法掺入法将受将受试物物0.1ml、菌液、菌液0.1ml分分别加入加入顶层培养基中，倒入底培养基中，倒入底层培养基中，培养基中，凝固后凝固后37培养培养48h观察察结果果AmesAmes试验方法及结果评价试验方法及结果评价点点样纸片周片周围长出一出一圈密集的圈密集的His+回回变菌菌落者，受落者，受试物即物即为阳阳性致突性致突变物物质。背景菌生背景菌生长良好受良好受试物物每皿回每皿回变菌落数增加一菌落数增加一倍以上并有倍以上并有剂量量-反反应关系，关系，试验结果具有重果具有重现性即可性即可认为该受受试物物为诱变阳性。阳性。结果与报告结果与报告1 实验结果判断与评价（1）点试法 凡在点样纸片周围长出一圈密集的his回变菌落者，该物质具有致突变性，即为阳性；如只出现少数散在菌落，则为阴性。（2）掺入法 突变率=诱发回变his菌落数/自发回变his菌落数 确认待测物具有致突变作用，必须具有以下几点：诱发突变His+菌落数为自发回变His+菌落数的2倍或2倍以上 回变菌落数随剂量增加而增加，并在一定剂量范围内剂量效应曲 线 呈直线 有可重复性 经统计学处理有显著差异 四四 注意事项注意事项